- (2011) Volume 5, Issue 2
İstanbul Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi, Yetiştiricilik Bölümü, İstanbul
Bacteria of the genus Vibrio, which is included in the family Vibrionaceae are commonly found in coastal and estuarine waters. Many Vibrio species can cause diseases in marine fish, crustacean and bivalve species. Moreover, many of them can infect humans after a contact with these animals or consumption of these animals and cause zoonoses. Vibrio harveyi, which was first isolated as a causative agent of a disease problem in a shark species in 1982, was deter-mined to cause diseases and mass mortalities especially in marine invertebrates and in a variety of fish species including aquacultured species such as gilthead sea bream, sea bass and salmo-nid fishes. Deep skin lesions and ulcers, gastroenteric disorders and eye lesions were observed in fish infected with V. harveyi. Primer isolation of this organism can be made on general me-dia such as Tryptic Soy Agar (TSA; supplemented with 2% NaCl) and Thiosulphate-Citrate-Bile salts-Sucrose (TCBS) (semi selective medium for Vibrio species). Besides, Vibrio harveyi Agar (VHA), a media which is developed specially for this species can be used for isolation and species identification. Chloramphenicol, ciprofloxacin and oxytetracycline are recom-mended for the control of disease by various researchers. The aim of this review is to present data to the fish farmers and fish health specialists on the etiology, epizootiology, pathogenicity, clinical symptoms and the pathology, diagnosis, protection and control of Vibrio harveyi and some studies on V. harveyi which is a worldwide distributed bacterium and the causative agent of diseases and mass mortalities in marine animals.
Vibrio harveyi, fish diseases, aquaculture
Vibrionaceae familyası üyesi Vibriolar kıyısal sularda ve haliçlerde yaygın olarak bulunan, Gram negatif, çomak şekilli bakterilerdir (Austin, 2010). Balık, kabuklu ve midye türlerinde hastalık yapmakla birlikte birçok Vibrio türü, bu canlıların tüketilmesi veya bu canlılarla temas sonucu insanlara da geçerek zoonoz teşkil etmektedir. Drouin de Bouville (1907)’ye göre bakteriyel kaynaklı ilk balık hastalığı Bonaveri (1761) tarafından tanımlanmıştır ve etkeni günümüzdeki adı ile yine bir Vibrio türü olan Listonella (=Vibrio) anguillarum olarak izole edilmiştir. Austin (2010)’e göre Grimontia (=Vibrio) hollisae, Photobacterium (=Vibrio) damselae subsp. damselae, V. alginolyticus, V. harveyi (=V. carchariae ve V. trachuri), V. cholerae, V. fluvialis, V. furnissii, V. metschnikovii, V. mimicus, V. parahaemolyticus ve V. vulnificus hem sucul canlılarda hem de insanlarda hastalık oluşturabilmektedir.
Denizel balıkların, omurgasızların ve özellikle de penaeid karideslerin önemli bir patojeni olan V. harveyi ilk olarak Johnson ve Shunk (1936) tarafından Achromobacter harveyi olarak adlandırılmıştır. Ardından sırasıyla Lucibacterium ve Beneckea genuslarına dahil edilen bu organizma en son olarak Baumann ve arkadaşları (1981) tarafından Vibrio genusuna dahil edilmiştir (Cano-Gomez ve ark., 2009). V. harveyi (Vibrio carchariae) hastalık etkeni olarak ilk defa 1982 yılında büyük camgöz köpek balığı (Carcharhinus plumbeus)’dan izole edilmiştir (Grimes ve ark., 1984). Pedersen ve arkadaşları (1998) gerçekleştirdikleri 16s rDNA sekans analizleri sonucunda V. carchariae’nin, V. harveyi’nin bir sinonimi olduğunu ortaya çıkart-mıştır. V. trachuri ise ilk olarak Japonya’da deniz suyu sıcaklığının 25 °C’nin üstüne çıktığı yaz aylarında hasta kültür Japon istavritleri (Trachurus japonicus)’nden izole edilmiştir (Iwamoto ve ark., 1995). Thompson ve arkadaşları (2002) tarafından bu organizmanın, V. harveyi’nin bir sinonimi olduğu öne sürülmüştür. Benzer bir patojen daha sonraları, yüksek oranlara ulaşan mortalite ile seyreden hastalık olguları sonucu başka köpek balığı türlerinden, orfoz balıklarından ve penaeid karideslerden izole edilmiştir (Austin, 2010). Zhang ve Austin (2000) gerçekleştirdikleri deneysel enfeksiyon çalışmasında farklı konaklardan ve coğrafik bölgelerden elde edilen V. harveyi suşlarının salmonid balık-lar için de patojen olduklarını tespit etmişlerdir. 1990’dan beri Güney Amerika, Avustralya ve Asya’da karides (Penaeus monodon ve Penaeus japonicus) kültüründe, özellikle larval evrelerde %100’e ulaşan mortalite ile seyreden enfeksiyonlar oluşturarak büyük ekonomik kayıplara yol açtığı rapor edilmiştir (Cano-Gomez ve ark.,2009).
Çeşitli araştırıcılar tarafından birçok yabani türden de izole edilmiş olan bu bakteri, Akdeniz bölgesinde Balebona ve arkadaşları (1998) ve Zorrilla ve arkadaşları (2003a) tarafından kültür çipura balıklarında (Sparus aurata) tek başına veya diğer Vibrio türleri ile birlikte karışık enfek-siyon şeklinde Vibriosis etkeni olarak izole edil-miştir. Pujalte ve arkadaşları (2003) İspanya’da gerçekleştirdikleri bir çalışmada kültür levrek ve çipura balıklarından izole ettikleri bu bakterinin özellikle levrek balıklarında daha baskın oldu-ğunu tespit etmişlerdir. Zorrilla ve arkadaşları (2003) İspanya’da dil balıkları (Solea senegalensis)’ndan hastalık etkeni olarak V. parahaemolyticus ve V. harveyi izole etmişlerdir. Buller (2004) V. harveyi’nin hem levrek hem de çipura balıklarında hastalık etkeni olduğunu bildirmiştir. Bai ve arkadaşları (2008)’e göre bu organizmanın Fransa, İspanya, Tunus, İtalya, Malta, Yunanistan ve Türkiye’de çipura ve levrek balıklarından izole edildiği rapor edilmiştir. Rigos ve Katharios (2009) Akdeniz’de kültürü yapılan alternatif türlerin hastalıkları üzerine yayınladıkları bir derlemede bu organizmanın sinarit (Dentex dentex), kırmızı mercan (Pagellus erythrinus), mercan (Pagrus auriga), dil balığı (Solea senegalensis) ve sarı kuyruk (Seriola dumerili) balıklarının temel bakteriyel patojenleri arasında bulunduğunun rapor edildiğini bildirmiştir. Luna ve arkadaşları (2010) tarafından V. harveyi’nin taş mercanlarında (Pocillopora damicornis) beyazlaşma sendromuna yol açan bakteri olduğu tespit edilmiştir.
Türkiye’de Korun ve Akaylı (2004) Ceratothoa oestroides ile enfeste kültür levrek balıklarının iç organlarından sekonder bakteriyel hastalık olgusu olarak V. harveyi izole etmişlerdir. Korun ve Timur (2008) kültür levrek balıklarından (Dicentrarchus labrax) Vibriosis etkeni olarak bu organizmayı izole etmişlerdir. Yalçınkaya ve arkadaşları (2003) Antalya bölgesindeki mavi yengeçlerde (Callinectes sapidus) insan patojeni Vibrio türlerinin varlığı ve antimikrobiyal duyarlılığı üzerine bir çalışma gerçekleştirmişlerdir ve bu çalışmaları sırasında V. harveyi de izole etmişlerdir. Ömeroğlu ve arkadaşları (2008) ise İzmir Körfezi’nde bazı omurgasız türlerinden ve deniz suyundan izole ettikleri V. harveyi izolatlarının fenotipik ve mo-leküler karakterizasyonu üzerine çalışmışlardır.
Bu derlemede su ürünleri yetiştiricilerine ve balık hastalıkları uzmanlarına, dünya çapında yayılım gösteren ve deniz canlılarında hastalıklara ve yoğun ölümlere yol açabilen V. harveyi’nin etiyolojisi, epizootiyolojisi, patojenitesi, klinik bulgular ve patolojisi, teşhisi, koruma ve kontrolü ile bu tür üzerine yapılan çeşitli çalışmalar hakkında bilgi sunulması amaçlanmıştır.
V. harveyi, denizel Vibrio türleri arasında en yaygın izole edilen türlerden biri olup; hem ser-best olarak hem de denizel hayvanların bağırsak mikrobiotasından sıkça izole edilmektedir (Pujalte ve ark., 2003). Diğer Vibrio türlerinde olduğu gibi denizel türlerin doğal mikroflorasında bulunur ve bu nedenle balık daima bu patojen ile karşı karşıyadır (Timur ve Timur, 2003) Normal olarak hastalık tuzlu su ve acı suda yaşayan balıklarda su sıcaklığının yük-sek olduğu yaz mevsiminin sonunda çıkar. Pujalte ve ark., (2003) çipura ve levrek için özel-likle sıcak aylarda (Haziran-Kasım ayları ara-sında) hastalık oluşturduğunu tespit etmişlerdir. Hastalık çıkışı su sıcaklığının yanı sıra çevresel faktörlerin de etkisi altındadır. Dahası, V. harveyi sıcak dönemlerde batı Akdeniz bölgesindeki bivalv türlerindeki heterotrofik türler arasında baskın olan türdür (Pujalte ve ark., 2003). Lüminöz bir bakteri olan V. harveyi, minimal be-sin gereksinimleri ve hızlı büyüyebilme özellik-leri ile kirlenmiş bölgelerde de yaşayabilmektedir (Özdemir ve ark., 2008).
V. harveyi, Gram negatif, hareketli, çomak şe-killi, fermentatif, sitokrom oksidaz ve katalaz po-zitif, TCBS’de sarı renkli koloni oluşturan ve O/129 (10μg)’ a dirençli fakat O/129 (150 μg)’a hassas bir türdür. V. harveyi’nin bazı fiziksel ve biyokimyasal özellikleri Tablo 1’de belirtilmiştir.
Table 1: Some physcial and biochemical properties of V. harveyi (Buller, 2004; Austin and Austin, 2007)
V. harveyi’nin virülens mekanizması ve patojenitesi henüz tam olarak anlaşılmamış olmasına rağmen, çeşitli araştırıcılar tarafından proteazlar, hemolizinler ve lipazlar, bir lipopolisakkarit ve bakteriosin benzeri maddeler gibi ekstrasellüler ürünlerin salgılanması, yeterli sayıyı algılama mekanizması (quorum sensing), dezenfektanlar ve antibiyotiklere karşı direnç oluşturmasını sağlayan biyofilm oluşturma özelliği, bakteriyofaj enfeksiyonları, sukroz fermentasyonu ve demir bağlama kapasitesi gibi çeşitli faktörlere bağlanmıştır (Cano-Gomez ve ark., 2009). Bunların yanı sıra sıcaklık, tuzluluk değişimleri gibi çevresel faktörlerin de V. harveyi’den kaynaklanan Vibriosis olgularında önemli rol oynadığı bildirilmiştir (Alavandi ve ark., 2006). Ayrıca konak türüne ve suşlar arasındaki farklılıklara bağlı olarak da V. harveyi’nin virülensinde büyük farklılıklar gözlemlenebilmektedir (Cano-Gomez ve ark., 2009).
V. harveyi’den kaynaklanan hastalık ol-gularında genel Vibriosis tablosu gözlemlenmektedir. Hasta balıklarda düzensiz yüzme, renkte koyulaşma, ekzoftalmus ve internal hemorajiler gözlemlendiği rapor edilmiştir. V. harveyi ile enfekte balıklarda deride derin lezyonlar, gastro enterik bozuk-luklar, gözde lezyonlar, infeksiyöz nekrotik enteritis, vaskülitis ve deride ülserler gözlemlenmiştir (Austin ve Zhang, 2006). Zorrilla ve arkadaşları (2003) İspanya’da 70 gram ağırlığındaki dil balıkları (Solea senegalensis) ‘nda gelişen ve deride ülserler, yüzgeçlerin ve ağzın civarında hemorajilerle ve %20 mortalite ile seyreden bir hastalık olgusunda etken olarak V. parahaemolyticus ve V. harveyi izole etmişlerdir. V. harveyi’nin etken olarak izole edildiği bazı hastalık olguları, enfekte balık türleri, ülkeleri ve araştı-rıcıları Tablo 2’de belirtilmiştir.
Table 2: Some fish species from which V.harveyi was isolated, clinical symptoms, countries and researchers (enhanced from Austin, 2010).
Enfekte dokulardan V. harveyi izolasyonu %2 NaCl içeren TSA besiyerinde gerçekleştirilebilmektedir (Pujalte ve ark., 2003; Korun ve Timur, 2008). TCBS agar besiyerinde sarı renkli koloniler oluşturmaktadır (Buller, 2004). TCBS agar, Vibrio türleri için selektif bir besiyeri olmakla birlikte, deniz ortamında var olan birçok Vibrio türünün üremesini engellemektedir. Ayrıca V. harveyi gibi sukroz fermentasyon test sonucu değişken olan türler için ayırt edici bir besiyeri değildir. Bu amaçla Harris ve arkadaşları (1996) tarafından geliştirilen Vibrio harveyi Agar besiyeri sahip olduğu yüksek pH değeri ve diğer denizel bakterilerin ihtiyaç duyduğu magnezyum iyonlarını içermemesi ile Vibrio genusuna ait ol-mayan bakterilerin üremesini engellemektedir. V. harveyi kolonileri bu besiyerinde, besiyeri içeri-ğindeki sellobiozu fermente ederek, ornitin dekarboksilasyonunu gerçekleştirerek ve optimal NaCl içeriği ile inkübasyon sıcaklığında diğer Vibrio türlerinden daha hızlı büyüme göstererek diğer türlerden farklı koloniler oluşturur. VHA besiyeri hazırlamak için 1.000 ml distile su içerisine 2 g D-Sellobioz, 2 g L-Ornitin, 30 g NaCl, 1.21 g Tris (hidroksimetil), 20 g agar, 0.075 g K2HPO4, 0.04 g Timol mavisi, 0.04 g bromotimol mavisi, 0.1 g pepton ve 0.1g maya ekstraktı eklenir ve içeriğindeki sellobiozun karamelize olma-sını önlemek için otoklavlanmadan yaklaşık 30 dakika veya besiyeri içeriği tamamen çözünene kadar 100 °C’de kaynatılır. Ardından besiyerinin sıcaklığı 56 °C’ye düşürülür ve 1 M NaOH ilavesi ile pH 9.0’a ayarlanarak steril petri kutularına dökülür. VHA besiyeri, katılaştığında gök mavisi renktedir.
V. harveyi, VHA besiyerinde 2-5 mm çapında, açık yeşil renkte, ortası koyu yeşil ve etrafında sarı hareler bulunan kolonilerin gelişmesiyle tanımlanır. Genel olarak kolonilerin kenarları düz olmakla birlikte kenarı tırtıklı koloniler de elde edilebilir (Harris ve ark., 1996). Ayrıca lüminöz karakterde oldukları için deniz suyu ile hazırlan-mış agar kültüründe üretildiklerinde, karanlık ortamda devamlı yeşilimsi bir parlaklık gösterirler (Timur ve Timur, 2003). Koyun kanı içeren besiyerinde β-hemoliz yaparlar (Buller, 2004). Organizmanın çeşitli besiyerleri üzerindeki gelişimi Şekil 1’de gösterilmiştir.
Figure 1: A) V. harveyi on MSA-B (Marine Salt Agar – Blood) 48 h. B) V. harveyi on BA (Blood Agar) 48 h. C) Yellow V. harveyi colonies on TCBS 48 h.
Bu organizmanın identifikasyonunun rutin bakteriyolojik yöntemlerin yanı sıra API 20E hızlı tanı kiti kullanılarak da gerçekleştirilebileceği çeşitli araştırıcılar tarafından bildirilmiştir (Liu ve ark., 1996; Gauger ve Gomez-Chiarri, 2002; Liu ve ark., 2004; Gauger ve ark., 2006). V. harveyi’nin teşhisi rutin biyokimyasal metotlarla yapılabildiği gibi, son yıllarda moleküler biyolojik veya serolojik metotlar da kullanılmaya başlanmıştır. Oakey ve ark., (2003) tarafından saf kültür halindeki V. harveyi izolatlarının, 16S rDNA sekansı kullanılarak, daha az biyokimyasal test kullanarak, kesin identifikasyon süresinin birkaç haftadan birkaç güne indirilebildiği bir PCR tekniği geliştirilmiştir. Fukui ve Sawabe (2007) tarafından bakteri izolasyonu, DNA saflaştırma teknikleri veya biyokimyasal testlerle desteklemeye gerek kalmadan 3 gün içerisinde organizmanın teşhis edilmesini sağlayan yeni bir PCR tekniği geliştirilmiştir. Robertson ve ark., (1998) tarafından Penaeid karideslerden ve çevreden elde edilen farklı V. harveyi izolatlarının güvenilir bir şekilde teşhisini sağlayan bir plak ELISA ve çubuk daldırma (dipstick) ELISA metodu geliştirilmiştir. Phianphak ve ark., (2005) tarafından deney farelerinde V. harveyi’ye karşı monoklonal antikorlar oluşturulmuş ve düşük konsantrasyonlarda bile bu bakterinin dot-blot analizlerinde hızlı ve güvenilir teşhisini sağlamışlardır.
Lüminöz bakterilerin kuluçkahane sistemlerine girişinin önlenmesi için suyun bir seri filtreden veya UV ışığından geçirilmesi tavsiye edilmektedir. Bakteriyel çoğalmayı engellemek için hijyen kurallarına uyulması ve tank tabanında biriken sediment ve döküntünün sifonlama ile temizlenmesi ve hastalık çıkışı halinde ise günlük olarak suyun %80-90’ının değiştirilmesi önerilmektedir (Timur ve Timur, 2003). Vibriosis sıklıkla rastlanılan bir hastalık problemi olduğundan dolayı hastalıktan korunmak için Türkiye’de özellikle levrek balığı yetiştiriciliğinde 1990’lı yıllardan itibaren başarıyla uygulanan ticari Vibriosis aşıları Listonella anguillarum serotip O1, L. anguillarum serotip O2 ve V. ordalii’ye ait antijenler içermektedir (Korun ve Timur, 2008). Ticari olarak V. harveyi antijenleri içeren herhangi bir aşı bulunmamakla birlikte, Ningqiu ve ark., (2008) tarafından V. harveyi izolatlarından 28 kDa ağırlığında bir dış membran proteini izole edilmiş ve tavşanlarda bu saflaştırılmış proteine karşı antikor gelişimi sağlanarak turuncu benekli orfoz balıkları (Epinephelus coioides) bu antikorlarla aşılanmıştır. Sonuç olarak aşılanan balıkların deneysel V. harveyi enfeksiyonlarına karşı direnç kazandıkları görülmüştür.
Liu ve arkadaşları (1997; 2004) Tayvan’da enfekte deniz balıklarından ve karideslerden izole ettikleri V. harveyi izolatları ile gerçekleştirdikleri antibiyogram duyarlılık testleri sonucunda bu organizmanın amfisilin, penisilin ve vanomisine karşı dirençli, kloramfenikol, siprofloksasin, doksisiklin, nalidiksik asit, nitrofurantoin, okzolinik asit, oksitetrasiklin, tetrasiklin ve sulfanomidlere karşı hassas olduğunu bulmuştur. Buna karşılık Korun ve Timur (2008) ise Türkiye’de levrek balıklarından izole ettikleri L.anguillarum, V. ordalii ve V. harveyi izolatlarının flumekuin, kanamisin, novobiosin, okzolinik asit, penisilin G ve tetrasikline karşı hassas, c sulfanomidler ve trimetoprime karşı dirençli olduklarını rapor etmişlerdir.
Akuakültürde, bakteriyel hastalıklardan kaynaklanan kayıpları önlemek için etkenin detaylı karakterizasyonu, etkene karşı profilaktif önlemler alınması, hastalığın teşhisi veya tedavisi açısından büyük önem taşımaktadır. Önceleri, birçok balık türünde ve özellikle de kültüre alınmış canlılarda hastalıklara ve yoğun ölümlere sebep olmasından ve zoonoz teşkil edebilmesiyle insanları da tehdit eden bir bakteri türü olmasından dolayı geleneksel bakteriyolojik metotlar kullanılarak V. harveyi’nin fenotipik karakterizasyonu ve oluşturduğu hastalıklar sırasında meydana gelen anatomik ve histopatolojik değişimlerin belirlenmesi üzerine çalışmalar yürütülmüş olup, günümüzde PCR, Elektroforez uygulamaları ve ELISA gibi moleküler ve serolojik tekniklerin kullanımına ve bu organizmanın genotipik karakterizasyonuna yönelik bir eğilim vardır. Sucul ortamda yaygın olarak bulunabilen bakterilerden kaynaklı hastalıklar, akuakültürde büyük ekonomik kayıplara yol açtığından dolayı balıkların bu etkenlere karşı aşılanması koruyucu önlem olarak yaygın bir biçimde kullanılmaktadır (Lopez-Romalde ve ark., 2003; Bos ve ark., 2004; Qian ve ark., 2008). Organizmanın virülens mekanizmasının anlaşılması ve patojenitesi ile ilgili yapıların belirlenerek etkin aşılar geliştiril-mesi ile kültür balıkçılığındaki kayıplar en düşük seviyeye indirilebilir.
Vibriosis, deniz balıklarının en önemli hastalıklarından biridir ve akuakültürde büyük kayıplara yol açmaktadır. Önceki raporlar, bu organizmanın özellikle kültür levreklerinde ve kültüre alma çalışmaları devam eden sinarit, mercan gibi sparid balıklar ile penaeid karideslerin temel patojenleri arasında olduğunu göstermektedir. Bu nedenle bu canlıların kültüründe kayıpların en düşük seviyelere indirilebilmesi için, bu ve diğer Vibrio türleri tarafından oluşturulan vibriosise karşı koruyucu önlemlerin alınması, aşılama uygulamalarının yapılması ve tedavisi sırasında flumekuin, kanamisin, novobiosin, okzolinik asit, penisilin G ve tetrasiklin kullanılması önerilmektedir. Ayrıca ülkemizde özellikle son yıllarda kültür balıklarında hastalık oluşturduğu rapor edilmeye başlanan bu organizmanın Türkiye sularındaki suşlarının fenotipik ve genotipik özelliklerinin belirlenmesi, antijenik yapılarının tespit edilmesi ve buna bağlı olarak uygun aşılar üretilmesi; tedavisinde kullanılabilecek uygun antibiyotiğin belirlenmesi için daha detaylı antibiyogram duyarlılık testlerinin gerçekleştirilmesi önerilmektedir.
