Journal of FisheriesSciences.com

Keywords

Fish health, Fish diseases, Fisheries, Aquaculture, Immunostimulant

Giriş

Balık yetiştiriciliğinde karşılaşılan ve ürün kalitesini düşüren, maliyeti arttıran ve hatta çoğu kez toplu balık ölümlerine neden olan balık has-talıklarının incelenmesi ve tedavisi her geçen gün biraz daha önem kazanmaktadır. Balık hastalıkla-rına hem doğal ortamlarda hem de yetiştiricilik sırasında rastlanabilir. Birçok hastalık etmeni do-ğal ortamlarda sürekli olarak bulunur, ancak yo-ğunlukları nadiren tehlikeli boyutlara ulaşır ve dolayısıyla problem yaratmazlar. Yetiştiricilikte amaç ticari bir başarı elde etmek olduğu için ba-lıklar doğal ortamlardakinden daha yüksek yo-ğunlukta stoklanır ve bu da hastalıkların gelişme-sine ve çok hızlı bir şekilde yayılmasına yol açan başlıca faktörlerden biridir (Scholz, 1999).

Su ürünleri yetiştiriciliğinde üretimin belirli aşamalarında meydana gelen kayıplar için kabul edilebilir sınırlar vardır. Ancak bu kayıplar epi-zootikler sırasında oldukça artar. Buna tedavi masrafları ve tedavi sırasında balıkların büyüme-sinin olumsuz etkilenmesi de eklenince maddi kaybın boyutları daha da yükselir (Francis-Floyd, 1990a). Doğal ortamda hasta veya zayıf düşmüş balıklar kısa bir sürede predatörler tarafından or-tamdan elimine edildikleri için doğal ortamlarda meydana gelen kayıplar hakkında yeterli bilgi edinmek güçtür (Scholz, 1999). Ayrıca doğal or-tamlarda balıklar, kültür ortamındakinden çok daha düşük yoğunluklarda bulunurlar. Dolayı-sıyla parazitler ve patojenler doğal ortamlarda nadiren büyük bir tehlike oluşturur. Ancak hasta-lık olayının gelişmesi genellikle sadece parazit veya patojen ve konak arasındaki ilişkinin sonu-cunda meydana gelen basit bir olay değildir. Hastalığın gelişmesi için balığı fizyolojik olarak optimum durumdan saptıran, immün sistemi olumsuz etkileyen ve/veya baskılayan etmen ya da etmenlerin de ortamda bulunması gereklidir (Rottmann vd., 1992).

Balıklarda diğer omurgalılarda olduğu gibi bağışıklık sistemi non-spesifik ve spesifik olmak üzere 2 kısım altında incelenmektedir. Ancak ba-lıkların savunma sistemi yüksek omurgalılarda-kinin aksine daha çok non-spesifik immüniteye dayanmaktadır (Watts vd., 2001). Bunun balıklar için bazı avantajları vardır; patojenle daha önce-den karşılaşılmış olması gerekmez, hastalık et-menine anında cevap verilebilir, spesifik sistemin aktive olması non-spesifik sistemin aktive olma-sına bağlıdır ve spesifik sistem su sıcaklığı düş-tükçe daha yavaş çalışır ancak non-spesifik sis-temin çalışması su sıcaklığına bağlı değildir (Watts vd., 2001).

Ayrıca balıklarda memelilerden farklı olarak; balıklarda kemik iliği ve lenf düğümleri yoktur, balıklarda kan yapımından sorumlu organlar ön böbrek ve dalaktır, balıklarda eritrositler çekir-deklidir ve balıklarda immünitenin anneden yav-ruya geçmesi söz konusu değildir. Ancak yapılan son birkaç çalışmada özellikle tilapya balıkla-rında anne ağzında mukusla beslenmeye bağlı olmak üzere yavrulara kısmen immünitenin ge-çebileceği gösterilmiştir (Takemura ve Takano, 1997).

Balık Sağlığı Yönetimi

Balık sağlığı yönetimi balıkları hastalıktan ko-rumak üzere tasarlanmış idari uygulamaları an-latmak için balık yetiştiriciliğinde kullanılan bir terimdir. Başarılı bir balık sağlığı yönetiminde balıkların tedavisinden ziyade, onları hastalıktan korumaya yönelik önlemler daha ön plandadır. Balıkları hastalıktan korumak ise uygun su kali-tesi, besleme ve ileri bir sanitasyon teknikleri gibi uygulamalar ile sağlanabilmektedir (Francis-Floyd, 1990a).

Çevresel koşulların optimum değerlerden sapması sonucunda balıklarda direncin azaldığı birçok çalışmada gösterilmiştir (Anderson, 1997; Bly vd., 1997). Değişen çevre koşullarına aşırı stok yoğunluğu, ani sıcaklık değişimleri, yetersiz oksijen seviyesi ve uygun olmayan elle müdahale gibi işlemler eklendiğinde balığın sınırlı home-ostatik mekanizması üzerinde önemli düzeyde stres yüklenmektedir. Stres, organ fonksiyonları-nın optimum dengeden uzaklaşması durumudur ve buna yol açan her türlü madde, işlem veya uy-gulama stresör olarak tanımlanmaktadır (Francis-Floyd, 1990b). Bununla birlikte stres hayvanın optimum koşullar dışında verdiği adaptif fizyolo-jik yanıtlar toplamı olarak da tanımlanabilmekte-dir (Wendelaar-Bonga, 1997). Stresin balıklarda immün sistemi baskıladığı ve bunun uzun vadede balıkları hastalıklara karşı daha savunmasız hale getirebileceği birçok çalışmada gösterilmiştir (Francis-Floyd, 1990b; Yavuzcan vd., 2006; Ya-vuzcan vd., 2009; Yavuzcan and Ergönül, 2010). Stres, akut veya kronik olabilmektedir. Elle mü-dahale, boylama, toplama, nakil gibi her işlet-mede yapılan işlemler akut stres; balıkların yük-sek yoğunlukta stoklanması veya suda istenme-yen maddeler bulunması, yetersiz oksijen sevi-yesi veya uygun boylama yapılmaması gibi et-menler ise kronik stres yaratmaktadır (Rottmann vd., 1992).

Stres altında verilen ilk fizyolojik yanıt adre-nal bezden kateşolaminlerin salgılanmasıdır. Bu hormonun ilk gözlenen etkisi kan glukoz seviye-sinde artıştır. Bu balığın acil enerji ihtiyacını kar-şılamak için verdiği bir tepkidir (Watts vd., 2001). Adrenal bezden salgılanan kateşolaminler ve kortizolün balık sağlığı açısından yetiştiriciyi ilgilendiren en önemli etkisi ise uzun vadede ba-lığın immün sisteminin baskılanmasıdır (Reid vd., 1998). Ayrıca balığın osmoregülasyon kapa-sitesi de bozulur; tatlısu balıkları ortamdan yük-sek miktarda su absorbe eder, deniz balıkları ise su kaybeder. Balık bu durumu normale döndür-mek için ekstra bir enerjiye daha ihtiyaç duyar. Solunum oranı artar, kan basıncı düşer ve genel-likle kırmızı kan hücresi miktarı artar. Balıklar normalde stresin oluşturduğu bu ilkin etkilere da-yanabilir. Ancak stresöre maruz kalma süresi ve/veya balıkların ikinci bir stresöre maruz bıra-kılması balıkların enerji rezervlerinin tükenme-sine yol açabilir (Reid vd., 1998). Bu durum ba-lıkların fırsatçı patojenlere karşı savunmasız hale gelmesine yol açabileceği gibi direkt ölüme de yol açabilir (Sommerset vd., 2005). İşletmede yapılan her işlem balıklar için bir stres faktörü-dür. Dolayısıyla balıkların immün sistemi üze-rinde baskılayıcı etkileri olan, onları hastalığa karşı daha duyarlı hale getiren bu işlemlerin ya-rattığı stresi minimuma indirmek için işletme-lerde dikkat edilmesi gereken faktörler ayrı bir önem oluşturmaktadır.

Balık Hastalıklarında Profilaksi ve İmmunostimulasyon

Balık hastalıklarının tedavi edilerek çözümü genellikle çok zordur. Bu bağlamda balık yetişti-riciliğinde her zaman profilaktik tedbirler ön plana çıkmaktadır (Le Breton, 2009). Balık sağlı-ğını tehdit eden sorunların başında özellikle mik-robiyal hastalıklar gelmektedir. Mikrobiyal bir hastalık ile karşılaşıldığında çoğu kez hastalık etmeni teşhis bile edilemeden hastalık tesisteki tüm balıklara yayılmış olur. Dolayısıyla mikrobi-yal hastalıkların daha hastalık gelişmeden engel-lenmesine yönelik tedbirler oldukça önemlidir. Bu durum medikal profilaksi olarak adlandırıl-maktadır. Ayrıca dirençli bireylerin damızlık ola-rak seçilmesi, su kalitesinin izlenmesi, yüksekkaliteli yem kullanılması ve balıkların stresten uzaktan tutulmasına yönelik işlemler işletmelerde zaten uygulanmaktadır. Ancak hastalıklarla mü-cadelede sadece bu önlemler yeterli değildir. Gü-nümüzde araştırmaların çoğu balıkların immün sisteminin uyarılması ve herhangi bir hastalık etmeni ile karşılaşma durumunda daha hızlı ve etkin bir cevap verilmesine yöneliktir (Bricknell ve Dalmo, 2005). Burada ise karşımıza immu-nostimulanlar çıkmaktadır.

En genel tanımı ile immunostimulasyon; im-mün sistemin aktive olması, ekspresyonu ve/veya verilen cevabın amplifikasyonudur. Diğer bir de-yişle; non-spesifik veya spesifik immün sistemi uyaran ve canlıyı hastalıklara karşı daha dirençli hale getiren herhangi bir madde, işlem veya uy-gulama immunostimulan olarak adlandırılmakta-dır (Sakai, 1999). Balık sağlığı yönetimi ile ilgili yapılan çalışmaların büyük bir kısmı son 20 yılda balık hastalıklarının tedavisinden ziyade balıkla-rın immün sistemlerinin güçlendirilmesine ve dolayısıyla immunostimulanların kullanımına yönelmiştir (Raa, 1996; Sakai, 1999; Peddie ve Secombes, 2005). Bunun nedenleri;

• Hastalıkların tedavisinde kullanılan çoğu kimyasalın insan sağlığı üzerinde tehdit oluşturması ve dolayısıyla pek çok ülkede yasaklanması.

• Kullanılan profilaktik kimyasalların çevre sağlığı açısından tehdit oluşturması ve doğal hayvan populasyonlarını etkilenmesi.

• Tedavi amaçlı antibiyotik kullanımı sonu-cunda tesis etrafındaki doğal ortamda antibiyotiklere dirençli bakteri suşlarının gelişebilmesi.

Spesifik immün sistemi uyaran immunosti-mulasyon için en iyi bilinen yöntem aşılamadır ve spesifik bir hastalık etmenine karşı direnci arttırmakta ve/veya koruma sağlamaktadır (Sommerset vd., 2005). Ancak balıklar söz ko-nusu olduğunda henüz her antijene karşı aşı ge-liştirilememiştir. Bakteriyel hastalıklar için daha çok öldürülmüş, viral hastalıklar için ise inaktive edilmiş aşılar kullanılmaktadır (Lorenzen, 1999). Bununla birlikte son yıllarda rekombinant aşılar ve DNA aşılar üzerine de çalışmalar yapılmakta-dır (Lorenzen ve La Patra, 2005). Ancak aşıla-manın da bazı dezavantajları bulunmaktadır;

• Öncelikli olarak her bir antijene karşı aşı geliştirilememiştir. Günümüzde ticari olarak piyasada bulunan aşı sayısı çok azdır

(vibriozis, kızıl ağız, frunculozis ve IPN gibi anti-viral aşılar) ve her patojen için aşı geliştirmek mümkün değildir. Örneğin, beyaz benek hastalığının etmeni olan Ichthyophthirius multifiliis çok yaygın ve çok tehlikeli bir protozoon olmasına karşın henüz etkinliği kesin olan bir aşı geliştirilememiştir (Burkert vd., 1990).

• Balığın genellikle 15g’dan büyük olması gerekir, daha küçük balıklara aşılama uygulanamaz. 15g altındaki balıklarda spesifik immnünite henüz gelişmemiştir ve bu boyda balıklara aşı yapmak oldukça zordur (Ellis, 1989).

• Aşılar banyo, sprey, oral ve enjeksiyon yöntemleriyle uygulanmaktadır. İlk üç yöntem uygulama açısından oldukça pratik olmakla birlikte etkinliğinden emin olmak güçtür dolayısıyla en iyi sonuçlar enjeksiyon yöntemi ile alınmaktadır. Ancak enjeksiyon yönteminde balıklar elle müdaheleden geçmek durumundadır. Bu ise külfetli bir iş olmasının yanında balıklar için ekstra bir stres kaynağıdır (Sommerset vd., 2005).

Aşılama spesifik bir antijene karşı oldukça et-kin bir koruma sağlasa da yukarıda sayılan ne-denlerden dolayı balık hastalıkları ile mücadelede başarı elde etmek için sadece aşılara güvenmek yeterli değildir. Dolayısıyla balıklarda non-spesi-fik immün sistemi uyaracak immunostimulanla-rın kullanımı ön plana çıkmaktadır. Normal ko-şullarda balıkların immün sistemi hastalık etme-nini etkisiz hale getirebilir. Ancak yumurtadan yeni çıkmış larvalarda ve 5-10 g’a kadar olan yavrularda immün sistem nispeten iyi gelişmemiş olduğundan yavru balıklar için aynı durum söz konusu değildir. Ayrıca ergin balıklar söz konusu olduğunda dahi immün sistem üzerinde etkili olan faktörlerden herhangi birinin bozulması veya balığın aleyhine gelişmesi immün sistemi zayıflatır ve balık, hastalığa karşı savunmasız hale gelir. Özellikle viral ve bakteriyel hastalıklar çok hızlı bir şekilde geliştiğinden ve yayıldığın-dan tedavi çoğu kez işe yaramaz. İmmunostimu-lanlar genel olarak hastalıklarla ve strese bağlı immun sistemin baskılanmasına karşı iyi bir çö-züm olmalarına rağmen immunostimulanların da yetersiz kaldığı durumlar olabilmektedir. Ancak yine de immunostimulanlar balık sağlığı yöneti-minde pek çok avantaja sahiptir; profilaktiktir, spektrumu geniştir, çevreye etkisi yoktur veya yok denecek kadar azdır, etki mekanizması su sıcaklığından bağımsızdır, yemlerle birlikte çok kolay uygulanabilir. Bu bağlamda balık yetiştiri-ciliğinde en sık kullanılan immunostimulanlar genel olarak 5 grup altında toplanmaktadır (Sa-kai, 1999; Peddie ve Secombes, 2005);

1. Ölü patojenler ve ürünleri

2. Sentetik kimyasallar

3. Bitkisel ürünler

4. Hayvansal ürünler

5. Besinler ve Mikronutrientler

Ölü patojenler ve ürünleri

Freund’s complete adjuvant (FCA)

FCA mikobakteriyel hücre duvarının mineral yağ içinde çözülmesi ile elde edilen bir süspansi-yondur (Moritana vd., 1992). Brenek vd. (2002) havuz balıklarına (Carassius carassius) FCA en-jekte etmiş ve Trypanosoma danilewskyi enfeksi-yonuna karşı koruyucu etkisi olduğunu göster-mişlerdir. Högfors vd. (2008) Flavobacterium psychrophilum’dan izole ettikleri ve antijenik özelliğe sahip bir proteini gökkuşağı alabalıkla-rına enjekte etmiş ve bu proteinin tek başına kul-lanılmasının balıklarda beklenen immün cevabı oluşturmadığını ancak FCA ile birlikte verilmesi durumunda koruyucu etkisi olduğunu kaydet-mişlerdir. Chettri vd. (2009) Poecilia reticu-lata’da yaptıkları bir araştırmada çeşitli Tetrahy-mena sp. preparasyonlarının balıklarda etkilerini incelemiş ve bu preparasyonların FCA ile birlikte kullanılması durumunda koruyuculuklarının art-tığını ve buna bağlı olarak balıklarda mortalite oranının %15 civarında düştüğünü bildirmişler-dir. FCA’dan tek farkı içinde Mycobacterium ürünleri bulunmaması olan FIA (Freund’s In-complete Adjuvant) da balıklarda immunostimu-lan olarak kullanılmaktadır. FIA’nın humoral ve hücresel bağışık yanıtta rol alan bileşenlerin sen-tezini arttırdığı özellikle tumor necrosis factor (TNF) gibi bazı sitokinlerin sentezinden sorumlu genleri aktive ettiği düşünülmektedir. Ancak FIA genellikle bazı olumsuz yan etkiler de gösterdi-ğinden insan sağlığında kullanımı yasaklanmıştır. Jiao vd. (2010) Paralichthys olivaceus adlı balık türünde yaptıkları bir çalışmada balıklara Et49 adlı Edwardsiella tarda antijenini FIA ile birlikte enjekte etmiş ve deneysel enfeksiyon çalışma-sında FIA’nın aluminyum tuzları gibi klasik ad-juvanlara göre çok daha iyi bir sonuç verdiğini gözlemişlerdir.

Kolera toksini ve non-toksik B alt birimi

Hebert vd. (2000) kolera toksininin (CT) ve non-toksik B alt biriminin (CTB) balıklara adujan olarak intraperitonal enjeksiyonunun serum anti-kor titresini arttırdığını bulmuşlardır. Benzer şe-kilde Merino-Conteras vd. (2001), Paralabrax maculatofasciatus’da yaptıkları bir çalışmada Ae-romonas veronii’den elde edilen ve antijenik özelliğe sahip bir lektini CTB ile birlikte oral yoldan kullanmış ve yapılan deneysel enfeksiyon çalışması sonucunda antijenin CTB ile birlikte kullanılmasının mortaliteyi %70 oranında düşür-düğünü tespit etmişlerdir. Irie vd. (2003) sazan balıklarında (Cyprinus carpio) yaptıkları bir ça-lışmada oral CTB ve BSA’yı (Bovine Serum Al-bumin) birlikte vermişler ve BSA’nın tek başına verilmesi durumunda antikor titresinin değişme-diğini ancak BSA+CTB verilmesi durumunda en yüksek antikor titresine ulaşıldığını kaydetmiş-lerdir.

Muramil peptidler

Muramil dipeptid (MDP) biyolojik olarak ak-tif bir mikobakteriyel peptidoglukan türevidir (N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine) ve Mycobacterium’dan elde edilmiştir (Secombes, 1994). Muramil dipeptidlerin balıklarda hastalık direncini arttırdığı bununla birlikte ön böbrekten izole edilen lökositlerin fagositik ve kemotaktik aktivitelerini arttırdığı belirlenmiştir (Kodama vd., 1993). Ackerman vd. (2000) gökkuşağı ala-balıklarında yaptıkları çalışmada balıklara Aero-monas salmonicida bakterini ile birlikte mura-mildipeptid (MDP) enjekte etmiş ve 5 hafta bo-yunca balıkları izlemişlerdir. Çalışma sonunda bakterin ve MDP enjekte edilen balıklarda spesi-fik büyüme oranı ve toplam lökosit sayısının kontrol grubuna oranla daha yüksek olduğunu bildirmişlerdir. Hirota vd. (1993) yaptıkları bir araştırmada gökkuşağı alabalıklarına (On-corhynchus mykiss) intraperitonal muramildid-pepdit enjekte ettikten 2 gün sonra ve balıklarda doza bağlı olarak ön böbrek fagositlerinde ke-motaktik cevabın ve fagositik aktivitenin arttığını tespit etmişlerdir.

Lipopolisakkaritler

Salmonella typhimurium veya Escherichia coli gibi gram negatif bakterilerin hücre duvarı-nın bir bileşeni olan lipopolisakkaritler (LPS), O-antijenleri ve endotoksin içeren karışımlar ha-linde kullanılmaktadır (Secombes, 1994). Uygun dozlarda uygulanması durumunda LPS’nin hem in vivo hem de in vitro olarak immunostimulatif özelliklerinin olduğu gösterilmiştir. Yüksek or-ganizasyonlu hayvanlar lipopolisakkaritlere karşı son derece duyarlı olmalarına karşın, balıklar gibi nispeten düşük organizasyonlu canlılar nispeten dirençlidir. Balıklarda LPS’nin immün sistemi uyardığı ve sitokinler, akut faz proteinleri gibi immün sistem bileşenlerinin ekspresyonunu sağ-ladığı bilinmektedir (Swain vd., 2008). Örneğin; Selvaraj vd. (2006) sazan balıklarında (C. carpio) yaptıkları bir çalışmada β-glukanın, LPS ile bir-likte uygulanması durumunda daha koruyucu hale geldiğini ve Aeromonas hydrophila ile ya-pılan deneysel enfeksiyon çalışmalarında %100 başarı elde ettiklerini bildirmişlerdir. Nayak vd. (2008) E. coli’den elde edilen LPS’nin Labeo ro-hita’da etkilerini incelemiş ve 1 EU dozun im-mün sistem üzerinde uyarıcı, 10 EU dozun ise baskılayıcı etkileri olduğunu gösternişlerdir. Ay-rıca bazı çalışmalarda LPS’nin yemlerin kaplan-ması suretiyle de kullanılabileceği gösterilmiştir (Guttvik vd., 2002). Diğer taraftan ultra saf LPS preparasyonlarının balıklarda hiçbir etkisinin ol-madığı ancak ticari LPS preparasyonlarında bu-lunan lipoprotein veya peptidoglukanın immu-nostimulatif etkisi olduğu bildirilmiştir (Iliev vd., 2005).BCG (Bacille calmette guerin)

BCG (Bacille calmette guerin)

BCG, Mycobacterium bovis’ten elde edilen bir hücre duvarı preparasyonudur. BCG’nin sito-kin sentezini ve fagositik faaliyetleri arttırdığı bilinmektedir (Galeotti, 1998). Grayson vd. (1987) enterik kızıl ağız (Enteric Redmouth dise-ase; ERM) hastalığına karşı alabalıklarda BCG’yi ERM aşısında adjuvan olarak kullanmış ve koru-yuculuğun arttığını saptamıştır. Kato vd. (2010) Paralichthys olivaceus’ta yaptıkları bir çalışmada balıklarda BCG’nin, balıklarda mycobacteriozise neden olan Mycobacterium sp.’ye karşı koruyucu etkilerini araştırmışlardır. Çalışma sonunda BCG enjekte edilen balıklarda IL-6 (İnterlökin) ve TNFα (Tumor Necrosis Factor) gibi sitokinlerin miktarının arttığını, aynı zamanda non-spesifik bakterisidal proteinlerin (lizozim gibi) miktarının arttığını, dolayısıyla bu hastalığa karşı koruyucu etkisi olduğunu göstermişlerdir. Yine Kato vd., (2011) Mycobacterium sp. ile enfekte Seriola dumerili’de yaptıkları bir çalışmada BCG’nin int-raperitonal ve intramuskuler enjeksiyonun koru-yucu etkilerini araştırmışlar ve en yüksek koru-yucu etkinin intraperitonal enjeksiyonla sağlan-dığını tespit etmişlerdir.

Glukan

Çeşitli mantar ve mayalardan elde edilen glu-kanlar özellikle de β-glukanlar (Robertsen vd., 1994) balık sağlığı yönetminde en sık kullanılan immunostimulanlardır. Piyasada çeşitli oranlarda glukan içeren pek çok ticari ürün bulunmaktadır. Örneğin Saccharomyces cerevisiae’den elde edi-len glukan içeren preparasyon piyasada Macro-gard adıyla satılmaktadır. Benzer şekilde Lenti-nus edodes’den elde edilen Lentinan, Schi-zophyllum commune’den elde edilen Schi-zophyllan, Sclerotium glucanicum’dan elde edi-len ise Scleroglucan adıyla bilinen ticari glukan preparasyonları balıklarda immunostimulan ola-rak kullanılmaktadır. Bunlardan en fazla kullanı-lan ve deneysel çalışmaya konu olan ise S. cere-visiae‘den elde edilen maya glukanıdır (Peddie ve Secombes, 2005). Pek çok çalışmada maya glukanı ile beslenen balıklarda bakteriyel (Raa, 1996), protozoonal (Peddie ve Secombes, 2005) ve viral (La Patra vd., 1998) hastalıklara karşı direnç artışı gözlenmiştir. Yapılan in vitro çalış-malarda da fagositik faaliyetlerin ve serum bakte-risidal aktivitesinin arttığı saptanmıştır (Ortuno vd., 2002). Lentinan ile yapılan çalışmalarda ise lentinan enjekte edilen (2-10 mg/kg vücut ağır-lığı) sazan balıklarında (C. carpio) deneysel Edwardsiella tarda enfeksiyonuna karşı direncin ve lentinan enjekte edilen sazan balıklarında fa-gositik aktivitenin arttığı gösterilmiştir (Yano vd., 1991). Matsuyama vd. (1992) schizophyllan en-jekte ettiği sarı kuyruk balıklarında (Seriola quinqueradiata) kompleman sisteminin aktive olduğunu ve serum lizozim seviyesinin arttığını göstermiştir. Schizophyllan piyasada hazır prepa-rasyon olarak VitaStim ticari adıyla satılmakta-dır. S. glucanum’dan elde edilen scleroglucanın ise sazan (C. carpio) (Yano vd., 1991), ot sazanı (Ctenopharyngodon idella) ve tilapyada (Tilapia sp.) (Wang ve Wang, 1997) hastalık direncini arttırdığı gözlenmiştir. Wang ve Wang (1997) ayrıca scleroglucanın ot sazanı ve tilapyada, nöt-rofil sayısını arttırdığını ve NBT-pozitif hücre sayısında artışa yol açtığını saptamışlardır. Ku-mari ve Sahoo (2006), Clarias batrachus’a besin yolu ile β-glukan verilmesi durumunda respiratory burst aktivitesinin ve fagositik indeksin arttığını tespit etmişlerdir. Ancak bazı çalışmalarda glukanın 0,1-1,0 μg/mL’si makrofajlarda respiratory burst etkisini arttırırken, 10 μg/mL’lik dozun etkisiz olduğu hatta 50 μg/mL’lik dozun inhibitor etkisinin olduğu belirlenmiştir (Smith vd., 2003).

Sentetik kimyasallar

Levamisole

Levamisole aslında ruminantlarda parazitik enfeksiyonların tedavisinde kullanılmak üzere geliştirilmiş bir anti-helmintik ilaçtır (Raa, 1996). Ancak memelilerde yapılan çalışmalarda immu-nostimulatif etkilerinin olduğu gösterilmiştir. Bu-nun üzerine balıklarda da denenmeye başlanmış ve olumlu sonuçlar elde edilmiştir. Kumari ve Sahoo (2006) besin yolu ile alınan levamisole’un Clarias batrachus üzerindeki etkilerini incelemiş ve balıklarda NBT (Nitro-Blue Tetrazolium) ak-tivitesinin ve fagositik kapasitenin arttığını göz-lemlemişlerdir. Perera ve Pathiratne (2008) Catla catla’da yürüttükleri bir çalışmada balıkları 2 saat süreyle 1.25 ve 2.50 mg/L’lik levamisol ban-yosuna maruz bırakmış ve 56 gün boyunca ba-lıklarda bazı immün parametreleri incelemişler-dir. Çalışma sonunda lökokrit, toplam lökosit sa-yısı, fagositik aktivite ve serbest oksijen radikali üretiminde artış olduğu ve gözlenen bu etkinin dozdan bağımsız olduğunu bildirmişlerdir. Diğer taraftan A. hydrophila ile yapılan deneysel enfek-siyon çalışmasında da olumlu sonuçlar elde edil-miş ve gözlenen bu koruyucu etkilerin tüm ça-lışma periyodu boyunca kaydedildiğini bildir-mişlerdir. Şeker vd. (2011) gökkuşağı alabalıkla-rında yaptıkları bir çalışmada dalak ve ön böb-rekten izole edilen hücrelerde levamisolün etkile-rini araştırmışlardır. 10 gün boyunca 10, 50 ve 100 μg/mL’ lik levamisolle inkübe edilen hücre-lerde NBT (nitroblue tetrazolium) pozitif hücre sayısının ve fagositik aktivitenin 10 ve 50 μg/mL’lik dozlarda arttığını, 100 μg/ml’lik dozda ise herhangi bir farklılık olmadığını bulmuşlardır. Li vd. (2011) Squaliobarbus curriculus adlı balık türü üzerinde levamisolün etkilerini araştırdıkları in vitro bir çalışmada ön böbrek ve dalaktan izole edilen makrofajları çeşitli doz ve sürelerde leva-misol ile inkübe etmiş ve en yüksek respiratory burst aktivitesinin 10-3 ng/mL’lik dozda gözlendi-ğini, 103 ng/mL’ lik dozda ise herhangi bir deği-şim olmadığını tespit etmişlerdir. Ancak bununla birlikte son yıllarda yapılan bazı çalışmalarda do-zun balık türüne göre ayarlanmaması durumunda beklenenin aksine immunosupresif etkisinin ol-duğu gösterilmiştir ve araştırmacıların bir kısmı bunun artık immunostimulan olarak kullanılma-masını önermektedir (Mulero vd., 1998).

FK-565

FK-565, laktol tetrapeptidle (FK-156) çok ya-kından ilişkili bir peptiddir (Raa, 1996). FK-156, Streptomyces olivaceogriseus’dan ekstrakte edilmiştir ve deneysel çalışmalarda sıçanlarda mikrobiyal enfeksiyonların önlenmesinde koru-yucu rolü olduğu saptanmıştır (Mine vd., 1983) ve daha sonra balıklarda da intraperitonal enjek-siyon olarak kullanılmıştır ve fagositleri stimule ettiği gösterilmiştir (Galeotti, 1998). Kitao ve Yoshida (1986) gökkuşağı alabalıklarında (O. mykiss) yaptıkları çalışmada FK-565’in (1 mg/kg vücut ağırlığı) serum bakterisidal aktivitesini art-tırdığını ve ön böbrek lökositlerinde fagositik ak-tiviteyi arttırdığını saptamışlardır. Ayrıca FK-565’in Yersinia ruckeri ve A. salmonicida aşıla-rında birlikte verilmesinin daha olumlu sonuçlar verdiği, dolayısıyla iyi bir adjuvan olduğu da gösterilmiştir (Kitao vd., 1987).

Bitkisel maddeler

Quil-A

Quil-A Quillaja saponaria adı verilen bitki-den elde edilen bir saponindir. Saponinler birçok bitkide bulunan ve steroid ya da triterpen glikozit bileşikleridir. Balıklarda solunum epitelini zede-ledikleri için aşırı toksik etkiye sahiptirler. Gray-son vd. (1987) Quil-A saponinini Y. ruckeri aşısı ile birlikte adjuvan olarak kullanmış ve gökku-şağı alabalıklarında (O. mykiss) in vitro koşul-larda bakterisidal aktivitenin arttığını saptamıştır. Niromiya vd. (1995) S. quinqueradiata’da yap-tıkları çalışmada Quil-A’nın lökositlerin migras-yonu üzerinde olumlu etkileri olduğunu ve bu saponinin oral yoldan kullanılabileceğini bildir-mişlerdir. Ashida vd. (1999) kalkan balıklarında (Paralichthyes olivaceus) formalinle öldürülmüş Edwardsiella tarda ile birlikte Quil-A’yı adjuvan olarak kullanmış ve saponin verilen balıklarda deneysel enfeksiyondan sonra mortalitenin daha düşük olduğunu bulmuştur. Mostafa (2000), sa-zan balıklarında yaptığı bir çalışmada Quil-A’nın balıklarda non-spesifik savunma mekanizmasını uyardığını ve A. hydrophila’ya karşı koruyucu etkisi olduğunu bildirmiştir.

Glisirizin

Glycyrrhiza glabra adlı bitkiden elde edilen ve glisiritinik asit içeren bir saponindir. Glisiriti-nik asidin ise anti-enflamatuar ve anti-tümoral etkisi olduğu bilinmektedir. Edahiro vd. (1991) Seriola quinqueradiata’ da yaptıkları bir çalış-mada oral yoldan verilen glisirizinin balıklarda lizozim ve makrofajların aktivitesinde belirgin bir artışa yol açmadığını ancak bununla birlikte Edwardsiella seriola’ya karşı koruyucu etkisi ol-duğunu göstermişlerdir. Jang vd. (1995) yaptık-ları in vitro çalışmada gökkuşağı alabalıklarında (O. mykiss) makrofajların fagositik aktivitesinin arttığını saptamışlardır. Yuan vd. (2007) G. glabra, Astragalus membranaceus, Polygonum multiflorum ve Isatis tinctoria içeren bitkisel bir karışımın sazan balıklarında fagositik aktivite ve respiratory burst (hücresel solunum patlaması) aktivitesini arttırdığını tespit etmişlerdir.

Bitkisel ekstraktlar

Logambal vd. (2000), Ocinum sanctum’dan elde ettiği bir ekstraktı tilapya balıklarına enjekte etmiş ve nötrofil aktivitesinin arttığını bulmuştur. Ayrıca aynı ekstraktın A. hydrophila’ya karşı ko-ruyucu etkisinin de olduğu bulunmuştur. Pon-pornpisit vd. (2001) çeşitli bitkilerden oluşan bir karışımı (C-UPIII) Poecilia reticulata üzerinde denemiş ve Tetrahymena pyriformis ile deneysel enfeksiyona maruz bırakmışlar ve deneme sonu-cunda balıklarda hastalığa karşı direncin arttığını belirlemişlerdir. Peddie ve Secombes (2003) ise Cheimmun adı verilen bir bitkisel karışımı (Echi-nacea angustifolia, Eupatorium perfoliatum, Baptisia tinctoria) intraperitonal olarak alabalık-lara enjekte etmiş ve fagositozun arttığını sapta-mışlardır. Dügenci vd. (2003) gökkuşağı alaba-lıklarında (O. mykiss) 3 farklı bitkisel ekstraktın (Zingiber officinale, Urtica dioica ve Viscum al-bum) besin yolu ile balıklara verilmesinin immün sistem üzerindeki etkilerini araştırmışlar ve en yüksek respiratory burst ve bakterisidal aktivite-nin %1 Z. officinale verilen balıklarda gözlendi-ğini kaydetmişlerdir. Sivaram vd. (2004) Epinep-helus tauvina adlı balık türünde yüksek mortali-teye neden olan Vibrio harveyi enfeksiyonuna karşı bazı bitkisel ekstraktların besin yoluyla kullanımını araştırmışlar ve Ocimum sanctum ve Withania somnifera’nın hem büyüme hem de immün sistem üzerinde olumlu etkileri olduğunu ve mortalite oranlarını düşürdüğünü ancak My-ristica fragrans’ın immün sistemi baskıladığını kaydetmişlerdir.

Algal Ekstraktlar

Laminaria spp. gibi kahverengi alglerden elde edilen çeşitli ekstraktlar balıklarda immunosti-umlant olarak kullanılmışlardır. Özellikle L. hy-perborean’dan elde edilen ekstraktın Atlantik alabalıklarında makrofaj aktivasyonuna yol açtığı saptanmıştır (Dalmo ve Seljelid, 1995). Fujiki ve Yano (1997) ise sodyum alginatın sazanlarda (C. carpio) ön böbrek fagositlerinin yara bölgesine göçünde bir artışa neden olduğu belirlemiştir. L. digitata’dan elde edilen ve piyasada Ergosan adıyla satılmakta olan ekstraktın kullanıldığı bir çalışmada 500μg Ergosan enjeksiyonunun Channa striata’da immunostimulatif etkilerinin olduğu saptanmıştır (Miles vd., 2001). Watanuki vd. (2008) sazan balıklarında (C. carpio) üç gün süreyle besin yolu Spirulina platensis verilmesi-nin immün sistem üzerine etkilerini araştırdıkları bir araştırmada fagositik aktivitenin, respiratory burst aktivitesinin arttığını ve IL-1 ve TNFα gibi sitokinlerin miktarının yükseldiğini tespit etmiş-lerdir.

Hayvansal maddeler

Sitokinler

Çeşitli memeli hayvanlardan elde edilen IFN-γ (İnterferon), IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, MCP (Mo-nosit Chemotactic Protein) gibi sitokinler de ba-lıklar üzerinde immnunostimulant olarak kulla-nılmaktadır. Balıklarda immün sistemde rolü ol-duğu bilinen sitokinler ise IFNα ve β, IL-1, IL-8, TNFα’dır. Bunlardan en önemlisinin TNFα ol-duğu kabul görmekte ve bu sitokinin balık hasta-lıklarına karşı immunostimulan olarak kullanıla-bileceği öngörülmektedir. Yapılan bir çalışmada çipura balıklarına (Sparus aurata) oral yoldan, maya (Pichia pastoris) ve rekombinant DNA teknolojisi ile elde edilen TNFα verilmiş ve ko-ruyuculuğu araştırılmıştır. Çalışma sonucunda respiratory burst aktivitesinin TNFα verilen grupta arttığı ve TNFα’nın istenmeyen bir yan etkisinin olmadığı saptanmıştır (Streitenberger vd., 2011).

Eikosanoidler

Sentetik lökotrien B4, ile yapılan bir çalışmada kedi balıklarında (Syliorhinus canicula) (Hunt ve Rowley, 1986) ve gökkuşağı alabalığında (Sharp vd., 1992) lökositlerin proliferatif özelliklerinin arttığı saptanmıştır. Eikosanoid biyokimyasal yolunda önemli bir bileşen olan arakidonik asitin ise in vitro olarak trombosit aggregasyonunu art-tırdığı saptanmıştır. Yine arakidonik asitle yapı-lan bir çalışmada çipura balıklarının (S. auratus) stres sonrası mortalite oranlarının düştüğü sap-tanmıştır (Koven vd., 2001).

Dimerize Lizozim (KLP-602)

Lizozim doğal olarak monomer halinde bu-lunmaktadır ancak doğal koşullar altında birçok madde dimerize veya polimerize halde iken daha etkindir. Bu nedenle dimerize lizozimin daha et-kin olabileceği fikri doğmuş ve karasal hayvan-larda immunostimulatif etkilerinin gösterilmiş olması sebebiyle balık sağlığında da kullanıla-gelmiştir (Siwicki vd., 1998). Ayrıca dimerize lizozimin, lizozimin aksine daha az toksik etkiye sahip olduğu gözlenmiştir. Siwicki vd. (1998) intraperitonal olarak enjekte edilen dimerize lizo-zim ya da diğer adıyla KLP-602’nin balıklarda frunculosise karşı doza ve enjeksiyon tekrarına bağlı olmak üzere %40-50 dolayında bir koruyu-culuk sağladığını tespit etmişlerdir. Morand vd. (1999) yayın balıklarında (Silurus glanis) yap-tıkları bir in vitro çalışmada 5-50 μg/mL’lik KLP-602’nin respiratory burst ve makrofaj akti-vitesinde önemli düzeyde artışa neden olduğunu saptamışlardır. Aynı çalışmada KLP-602’nin ay-rıca intraperitonal enjeksiyonunun hücresel ve humoral immüniteyi tetiklediği ve A. hydrophila enfeksiyonuna karşı koruyucu etkisi olduğu da gösterilmiştir. Rymuszka vd. (2005) sazan balık-larında (C. carpio) yaptıkları bir çalışmada ba-lıklara bir pestisid olan cypermethirn’e maruz bıraktıktan sonra dimerize lizozim enjekte ederek immün fonksiyonları incelemiş ve hem in vivo hem de in vitro koşullarda balıklarda lenfosit proliferasyonunun ve fagositlerin metabolik akti-vitesinin arttığını bulmuşlardır.

Laktoferrin

Demir bağlayan bir glikoprotein olan laktofer-rin tek zincirli bir peptiddir ve molekül başına 2 demir bağlama bölgesi bulunmaktadır. Bovine laktoferrini ile yapılan bir çalışmada gökkuşağı alabalıklarının ön böbrek lökositlerinde kemolu-minesans ve fagositik aktivitede artış olduğu saptanmıştır (Sakai vd., 1993). Lygren vd. (1999) Atlantik alabalıklarında bovine laktoferrinin de-neysel A. salmonicida enfeksiyonuna karşı koru-yucu etkisi olduğunu göstermişlerdir. Ayrıca laktoferrinin Vibrio anguillarium ve Streptococ-cus sp.’ye karşı da koruyucu etkisi olduğu yapı-lan deneysel enfeksiyon çalışmalarında gösteril-miştir (Esteban vd., 2005). Clarias batrachus üzerinde yapılan bir çalışmada yem yolu ile alı-nan laktoferrinin balıklarda fagositik aktiviteyi ve myeloperoksidaz aktivitesini arttırdığı tespit edilmiştir (Kumari ve Sahoo, 2006).

Hormonlar

Hormonların balıklar üzerinde immunosti-mulan olarak kullanımını konu alan çalışmalar genellikle deneysel çalışmalardır. Watanuki vd.

(2000) 10 ng/ml beta-endorfin içeren bir karı-şımda inkübe ettikleri gökkuşağı alabalığı makro-fajlarında fagositik aktivitenin arttığını bulmuş-lardır. Ayrıca başka bir çalışmada sazan balıkla-rından (C. carpio) izole edilen fagositlerde supe-roksit anyon miktarının arttığı bulunmuştur (Watanuki vd., 2000). Sakai vd. (1997) yaptıkları bir çalışmada gökkuşağı alabalıklarına (O. my-kiss) büyüme hormonu enjekte etmişler ve enjek-siyondan 5 gün sonra Vibrio anguillarum ile de-neysel olarak enfekte edilen balıklarda mortalite oranının kontrol grubuna oranla düştüğünü kay-detmişlerdir. Keleş vd. (2002), sentetik bir östro-jen olan 2-20 ppm zeranolün gökkuşağı alaba-lıklarında doza bağlı olarak fagositik ve bakteri-sidal aktivitenin artmasını sağladığını bulmuşlar-dır.

Mikronutrientler

Balıklar üzerinde immunostimulatif etkileri en detaylı araştırılan mikronutrientler Vitamin C ve E olmuştur. Vitaminler kültür balıkçılığında kul-lanılan en pahalı ek besinlerdir. Vitmain C (Vit C) ve Vitamin E (Vit E) hücresel makromole-külleri normal metabolizma sırasında veya enfek-siyon, stres ve kirliliğe maruz kalma sırasında oluşan serbest oksijen radikallerinin kontrolsüz oksidasyonundan korur. Vit C’nin immunosti-mulan olarak etki gösterebilmesi yemdeki oranı-nın çok yüksek düzeylere çıkarılmasına bağlıdır. Vit E’nin de benzer şekilde yüksek dozda olması gereklidir. Ancak Vit E yağda eriyen bir vitamin olduğu için immunostimulatif doz ile toksik doz birbirine çok yakındır. Bu nedenle Vit E uygula-masında doz ayarlamasına aşırı dikkat etmek ge-rekir

Pek çok teleost, L-gulonolactone oksidaz en-zimi olmadığı için askorbik asit sentezleyemez. Bu nedenle balık yemlerinde eksojen Vit C ihti-yacı vardır. Vit C, suda çözünebilen bir redoks ajanı olarak iş görür ve Vit C yetersizliğinin spi-nal deformasyon, kollajen sentezinin engellen-mesi, büyümenin gerilemesi ve iç kanamaya yol açtığı bildirilmektedir (Merchie vd., 1997). Ay-rıca Vit C ile balığın immunitesi arasında bir ko-relasyon olduğu pek çok çalışmada gösterilmiştir (Paul vd., 2004). Cirrihinus mrigala’da 3 günlük larvalar 4 ay süreyle Vit C içeren besinle beslen-miş ve bu çalışmada balıklara A. hydrophila’ nın virulent bir suşu intramuskuler olarak enjekte edilmiş ve Vit C verilmeyen grupta mortalite oranının daha yüksek olduğu saptanmıştır. Ayrıca Vit C verilen grupta enjeksiyondan 3 gün sonra iyileşme belirtileri saptanmış ancak bu cevap Vit C verilmeyen grupta 9 gün sonra gözlenebilmiştir (Sobhana vd., 2002).

Vit E pek çok değişik formda bulunabilir; alfa-tocopherol en yüksek aktiviteye sahip for-mudur. Vit E yağda çözünebilen bir antioksidant olarak fonksiyon gösterir. Balıkların ihtiyaç duy-dukları Vit E miktarını temel olarak belirleyen, balıkların besin yolu ile aldıkları lipit miktarı özellikle de PUFA (polyunsaturated fatty acid) olarak adlandırılan doymamış yağ asidi miktar-dır. PUFA okside edilebilir bir molekül olduğu için oluşan ürünler hücreler üzerinde toksik etki gösterir. Ancak sucul canlılar için özellikle de sıcaklığın karasal ortama oranla daha düşük ol-duğu göz önüne alınırsa bu doymamış yağ asitleri oldukça önemlidir. Bu doymamış yağ asitleri hücre membran akışkanlığını sağlar. Vit E burada devreye girmektedir; fosfolipidlerdeki uzun zin-cirli doymamış yağ asitlerini oksidatif hasara karşı koruyarak hücre membranının korunmasına katılır ve oksidasyon sonucu oluşan toksik bile-şikleri ortadan kaldırır (Puangkaew vd., 2004). Vit E ayrıca eritrosit ömrünü uzatır ve Vit E ye-tersizliğinde anemi görülebilir. Ayrıca bol mik-tarda verildiğinde immün sistemi uyarıcı özelliğe sahiptir; lizozim aktivitesini arttırmaktadır, mak-rofajların fagositik yeteneğini arttırır ve alternatif kompleman sistemin etkinliğini arttırır. Bunların yanında et kalitesini arttırdığı bildirilmektedir (Paul vd., 2004).

Bazı çalışmalarda bu iki vitaminin birlikte ve uygun dozlarda verilmesinin daha iyi sonuçlar verdiği savunulmaktadır. Örneğin, strese maruz bırakılan ve Vit E+Vit C ile beslenen balıklarda kandaki glukoz seviyesinin kontrol grubuna göre %33 oranında daha düşük olduğu saptanmıştır (Ortuno vd., 2003). Vit E‘nin özellikle lipidler ve Vit C ile olan etkileşimlerinden dolayı Vit E‘nin fonksiyonları hakkında yorum yapmak zordur. Vit E‘nin aktif formu olan alfa-tocoferol anti-ok-sidant olarak iş gördüğünde radikal form olan to-koferoksile dönüşür. Vit C ise radikal formun tekrar aktif forma dönüşümünü sağlar.

Sonuç

İmmunostimulan seçiminde immunostimula-nın koruyucu etkilerinin uzun sürmesi isten-mektedir. Besin yolu ile veya enjeksiyon yöntemi ile uygulanan bir immunostimulanın tesiste sık aralıklarla tekrarlanması hem mali-yeti arttırır hem de pratikte bazı zorlukları be-raberinde getirir. Dolayısıyla uygulama bit-tikten sonra da bir süre daha bu etkilerin göz-lenmesi gerekir.

- Seçilen immunostimulanın pahalı olmaması ve kolay ulaşılabilir olması gerekir. Örneğin; sitokinler olumlu sonuçlar vermesine rağmen pratikte uygulanabilir görünmemektedir.

- İmmunostimulanın besin yolu ile de verilebil-mesi ve yine etkin bir koruma sağlaması gere-kir. Genel olarak en iyi sonuçların enjeksi-yonla alındığı bildirilmesine rağmen bu pra-tikte çok kullanışlı değildir ve 15g altındaki balıklara uygulamak zordur. Oral yoldan uy-gulamanın veya immersiyon yönteminin de tatmin edici sonuçlar verdiği bildirilmiştir. Oral yoldan uygulama, balıklarda enjeksiyona oranla daha az stres yaratır.

- Stimulasyonun düzeyi kontrol edilmelidir. Sti-mulasyonun çok yoğun olması balığa zarar verebilir ve hatta öldürebilir. Buna en iyi örnek insanlarda LPS verilmesi ile birlikte gelişen septik şok ve ölümdür (Morrison vd., 1994).

- Uygulanacak dozun seçimi çok dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Zira düşük dozlarda iste-nen etki gözlenmeyebilir, yüksek dozlar ise beklenenin aksine immunosupresyona yol açabilir.

- İmmunostimulanlar su ürünleri yetiştiriciliği açısından oldukça umut vericidir ancak bu konuda daha fazla çalışma yapılmalı ve kül-türü yapılan balık türleri için optimum immu-nostimulasyonu sağlayan immunostimulanlar araştırılmalıdır.

Kaynaklar

Ackerman, P.A., Iwama, G.K., Julian, C., (2000). Physiological and Immunological Effects of AdjuvantedAeromonassalmonicidaVac-cines on Juvenile Rainbow Trout, Journal of Aquatic Animal Health, 12: 157-164. doi: 10.1577/1548-8667(200006)012<0157:PAIEOA>2.0.CO;2

Anderson, D.P., (1992). Immunostimulants, ad-juvants and vaccine carriers in fish: applica-tions to aquaculture, Annual Reviews in Fish Diseases, 2: 281-307. doi: 10.1016/0959-8030(92)90067-8

Anderson, D.P., (1997). Environmental factors in fish health: Immnulogical aspects, Fish Phy-siology, 15: 289-310.doi: 10.1016/S1546-5098(08)60277-0

Ashida, T., Okimasu, E., Ui, M., Heguri, M., Oyama, Y., Amemura, A., (1999). Protec-tion of Japanese flounder Paralichthysoli-vaceusagainst experimental edwardsielliosis by formalin-killed Edwardsiellatardain combination with oral administration of im-munostimulants, Fisheries Science, 65: 527-530. doi: 10.2331/fishsci.65.527

Bly, J.E., Quiniou, S.M., Clem, L.W., (1997). Environmental effects on fish immune mec-hanisms, Developments in Biological Stand-ardization, 90: 33-43.

Bowser, P.R., Buttner, J.K., (1993). General fish health management. NRAC Bulletin No: 111. 12 pp.

Brenek, D.R., Plouffe, D.A., Wiegertjes, G.F., Belosevic, M., (2002). Immunization of goldfish with excretory/secretory molecules of Trypanosomadanilewskyiconfers pro-tection against infection, Developmental and Comparative Immunology, 26: 649-657. doi: 10.1016/S0145-305X(02)00018-6

Bricknell, I., Dalmo, R.A., (2005). The use of immunostimulants in fish larval aquaculture, Fish and Shellfish Immunology, 19: 457-472. doi: 10.1016/j.fsi.2005.03.008

Burkert, M.A., Clark, T.G., Dickerson, H.W., (1990). Immunozation of channel catfish IctaluruspunctatusagaintsI. Multifiliis, Jo-urnal of Fish Diseases, 13: 401-410. doi: 10.1111/j.1365-2761.1990.tb00799.x

Chettri, J.K., Leibowitz, M.P., Ofir, R., Zilberg, D., (2009). Protective immunization against Tetrahymenasp. infection in guppies, Fish and Shellfish Immunology, 27: 302-308. doi: 10.1016/j.fsi.2009.05.013

Dalmo, R.A., Seljelid, R., (1995). The immuno-modulatory effect of LPS, laminaran and sulphated laminaran (Beta(1,3)-D-Glucan) on Atlantic salmon, SalmosalarL, macrop-hages in vitro, Journal of Fish Diseases, 18: 175-185. doi: 10.1111/j.1365-2761.1995.tb00275.x

Dügenci, S.K., Arda, N., Candan, A., (2003). Some medicinal plants as immunostimulants for fish, Journal of Ethnopharmacology, 88: 99-106.Edahiro, T., Hamoguchi, M., Kusuda, R. 1991. Suppressive effect of glycyrrhizin against streptococcal infection promoted by feding oxidized lipids to yellow tail, Suisanzos-hoku, 39: 21-27.

Ellis, A.E., (1989). Fish Vaccination, Aquacul-ture Information Series, No:4. 8 pp.

Esteban, M.A., Rodriguez, A., Cuesta, A., Mese-guer, J., (2005). Effects of lactoferrin on non-spesific immune responses of gilthead seabream, Fish and Shellfish Immunology, 18: 109-124. doi: 10.1016/j.fsi.2004.06.003

Francis-Floyd, R., (1990a). Introduction to fish health management. CIR921. University of Florida. IFAS Series.

Francis-Floyd, R., (1990b). Stress: Its role in fish disease. CIR919. University of Florida. IFAS Series.

Fujiki, K., Yano, T., (1997). Effects of sodium alginate on the non-specific defence system of the common carp (CyprinuscarpioL.), Fish and Shellfish Immunology, 7: 417-427. doi: 10.1006/fsim.1997.0095

Galeotti, M., (1998). Some aspects of the appli-cation of immunostimulants and a critical review of methods for their evaluation, Jo-urnal of Applied Ichthyology, 14: 189-199. doi: 10.1111/j.1439-0426.1998.tb00641.x

Grayson, T.H., Williams, R.J., Wrathmell, A.B., Munn, C.B., Harris, J.E., (1987). Effects of immunopotentiating agents on the immune responses of rainbow trout, SalmogairdneriRichardson, to ERM vaccine, Journal of Fish Biology, 31: 195-202. doi: 10.1111/j.1095-8649.1987.tb05313.x

Guttvik, A., Paulsen, B., Dalmo, R.A., Espelid, S., Lund, V., Bøgwald, J., (2002). Oral ad-ministration of lipopolysaccharide to salmon fry. Uptake, distribution, influence on growth and immune stimulation, Aquacul-ture, 214: 35-53. doi: 10.1016/S0044-8486(02)00358-7

Harris, J., Bird, D.J., (1998). Alpha-melanocyte stimulating hormone (alpha- MSH) and mel-anin-concentrating hormone (MCH) stimu-late phagocytosis by head kidney leucocytes of rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) in vitro, Fish and Shellfish Immunology, 8: 631-638.doi: 10.1006/fsim.1998.0172

Hebert, P., Ainsworth, A.J., Boyd, B., (2000). Cholera toxin has adjuvant properties in cat-fish when injected intraperitoneally, Fish and Shellfish Immunology, 10: 469-474. doi: 10.1006/fsim.2000.0267

Hirota, Y., Mukamoto, M., Baba, T., Kodama, H., Azuma, I., (1993). Effect of muramyl di-petide on phagocyte functions in rainbow trout, Bulletin of University of Osaka Series B, 45: 67-74.

Högfors, E., Pullinen, K.R., Madetoja, J., Wiklund, T., (2008). Immunization of rain-bow trout with a low molecular mass frac-tion isolated from Flavobacterium psych-rophilum, Journal of Fish Disaeses, 31: 899-911. doi: 10.1111/j.1365-2761.2008.00956.x

Hunt, T.C., Rowley, A.F., (1986). Leukotriene B4 induces enhanced migration of fish leu-cocytes in vitro, Immunology, 59: 563-568.

Iliev, D.B., Roach, J.C., Mackenzie, S., Planas, J.V., Goetz, F.W., (2005). Endotoxin recog-nition: In fish or not in fish?,FEBS Letters, 579: 6519-6528.

Irie, T., Watarai, S., Kodama, H., (2003). Humo-ral immune response of carp induced by oral immunization with liposome-entrapped anti-gen, Developmental and Comparative Im-munology, 27: 413-421. doi: 10.1016/S0145-305X(02)00137-4

Jang, S.I., Hardie, L.J., Secombes, C.J., (1995). Elevation of rainbow trout Oncorhynchusmykissmacrophage respiratory burst activity with macrophage derived supernatants, Jo-urnal of Leukocyte Biology, 57: 943-947.

Jiao, X., Cheng, S., Hu, Y., Sun, L., (2010). Comparative study of effects of aluminum adjuvants and Freund’s incomplete adjuvant on the immune response to an Edwardsiellatardamajor antigen. Vaccine, 28: 1832-1837. doi: 10.1016/j.vaccine.2009.11.083

Kato, G., Kondo, H., Aoki, T., Hiruno, I., (2010). BCG vaccine confers adaptive immunity against Mycobacterium sp. infection in fish, Developmental and Comparative Immunol-ogy, 34: 133-140. doi: 10.1016/j.dci.2009.08.013

Kato, G., Kondo, H., Aoki, T. and Hirono, I., (2011). Studies on the development of a vaccine against Mycobacterium sp., pp. 317-328. In Bondad-Reantaso, M.G., Jones, J.B., Corsin, F. and Aoki, T. (eds.). Diseases in Asian Aquaculture VII. Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Selangor, Malaysia. 385 pp.

Keles, O., Candan, A., Bakirel, T., Karatas, S., (2002). The investigation of the anabolic ef-ficiency and effect of the nonspecific im-mune system of zeranol in rainbow trout (Oncorhynchusmykiss), Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences, 26: 925-931.

Kitao, T., Yoshida, T., Anderson, D.P., Dixon, O.W., Blanch, A., (1987). Immunostimula-tion of antibody-producing cells and humo-ral antibody to fish bacterins by a biological response modifier, Journal of Fish Biology, 31: 87-91. doi: 10.1111/j.1095-8649.1987.tb05298.x

Kitao, T., Yoshida, Y., (1986). Effect of an im-munopotentiator on Aeromonassalmonicidainfection and in rainbow trout (Salmogaird-neri), Veterinary Immunology and Immuno-pathology, 12: 287-296. doi: 10.1016/0165-2427(86)90132-7

Kodama, H., Hirota, Y., Mukamoto, N., Baba, T., Azuma, I., (1993). Activation of rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) phagocytes by muramyl dipeptide, Developmental and Comparative Immunology, 17: 129-140. doi: 10.1016/0145-305X(93)90023-J

Koven, W., Barr, Y., Lutzky, S., Ben-Atia, I., Weiss, R., Harel, M., Behrens, P., Tandler, A., (2001). The effect of dietary arachidonic acid on growth, survival and resistance to handling stress in gilthead seabream (Sparusaurata) larvae, Aquaculture, 193: 107-122. doi: 10.1016/S0044-8486(00)00479-8

Kumari, J., Sahoo, P.K., (2006). Non-spesific immune response of healthy and immuno-compromised Asian catfish (Clariasbatrac-hus) to several immunostimulants, Aqua-culture, 255: 133-141. doi: 10.1016/j.aquaculture.2005.12.012

La Patra, S.E., Lauda, K.A., Jones, G.R., Shew-maker, W.S., Bayne, C.J., (1998). Re-sistance to IHN virus infection in rainbow trout is increased by glucan while subsequ-ent production of serum neutralizing activity is decreased, Fish and Shellfish Immunol-ogy, 8: 435-446. doi: 10.1006/fsim.1998.0151

Le Breton, A.D., (2009). Farming and health ma-nagement: Prevention and policy measure, Options Meditarraneennes, 86: 207-220.

Li, G.F., Liu, L.B., Tan, Y.L., Lius, L.Z., Deng, H.Z., Wan, H., Zhong, W.Z., Chen, S.J., (2011). In vitro effect of levamisole on the cell viability, phagocytosis and respiratory burst of barbel macrophages, Aquaculture Nutrition, 17: 263-270. doi: 10.1111/j.1365-2095.2010.00760.x

Logambal, S.M., Venkatalakshmi, S., Michael, R.D., (2000). Immunostimulatory effect of leaf extract of Ocimum sanctum L. in Oreo-chromismossambicus(Peters), Hydrobiolo-gia, 430: 113-120. doi: 10.1023/A:1004029332114

Lorenzen, N., (1999). Recombinant vaccines: ex-perimental and applied aspects, Fish and Shellfish Immunology, 9: 361-365. doi: 10.1006/fsim.1999.0195

Lorenzen, N., La Patra, S.E., (2005). DNA vacci-nes for aquacultured fish, Review of Science and Technology- International Office for Epizootics, 24: 201-213.

Lygren, B., Sveier, H., Hjeltnes, B., Waagbö, R., (1999). Examination of the immunomodu-latory properties and the effect on disease resistance of dietary bovine lactoferrin and vitamin C fed to Atlantic salmon (Salmosalar) for a short-term period, Fish and Shellfish Immunology, 9: 95-107. doi: 10.1006/fsim.1998.0179

Matsuo, K., Miyazono, I., (1993). The influence of long term administration of peptidoglycan on disease resistance and growth of juvenile rainbow trout, Nippon Suisan Gakkaishi, 59: 1377-1379.

Matsuyama, H., Mangindaan, R.E.P., Yano, T., (1992). Protective effect of schizophyllan and scleroglucan against Streptococcus sp. infection in yellowtail (Seriolaquinqueradi-ata), Aquaculture, 101: 197-203. doi: 10.1016/0044-8486(92)90023-E

Merchie, G., Lavens, P., Sorgeloos, P., (1997). Optimization of dietary vitamin C in fishand crustacean larvae: a review, Aquacul-ture, 155: 165-181. doi: 10.1016/S0044-8486(97)00115-4

Merino-Contreras, M.L., Guzman-Murillo, M.A., Ruiz-Bustos, E., Romero, M.J., Cadena-Roa, M.A., Ascenio, F., (2001). Mucosal immune response of spotted sand bass Paralabraxmaculatofasciatusorally immunised with an extracellular lectin of Aeromonasveronii, Fish and Shellfish Immunology, 11: 115-126. doi: 10.1006/fsim.2000.0299

Miles, D.C., Polchana, J., Lilley, J.H., Kancha-nakhan, S., Thompson, K.D., Adams, A., (2001). Immunostimulation of striped sna-keheadChannastriataagainst epizootic ul-cerative syndrome, Aquaculture, 195: 1-15. doi: 10.1016/S0044-8486(00)00529-9

Mine, Y., Yokota, Y., Wakai, Y., Fukada, S., Nishida, M., Goto, S., Kuwahara, S., (1983). Immunoactive peptides, FK-156 and FK-565. I. Enhancement of host resistance to microbial infection in mice, Journal of Anti-biotics, 36: 1045-1050.

Morand, M., Siwicki, A., Pozet, F., Klein, P., Vinaize, J.C., Keck, N., (1999). Effects of dimerized lysozyme (KLP-602) on the cel-lular and humoral defence mechanisms in Silurusglanis: in vitro and in vivo study, Veterinary Research, 30: 411-418.

Moritana, T., Noda, H., Yamaguchi, I., Watanabe, T., (1992). Enhancement of granulocytepoiesis by Freund’s complete adjuvant in carp, Nippon Suisan Gakkaishi, 58: 1145-1149.

Morrison, D.C., Danner, R.I., Dinarello, C.A., Munford, R.S., Natanson, C., Pollack, M., Spitzer, J.J., Ulevitch, R.J., Vogel, S.N., McSweegan, E., (1994). Bacterial endotox-ins and pathogenesis of Gram-negative in-fections: current status and future direction, Journal of Endotoxin Research, 1: 71-83. doi: 10.1177/096805199400100201

Mostafa, A., (2010). Effect of Quil-A as an im-munostimulant on some non-spesificim-mune response parameters of common carp in experimental infection with Aeromonashydrophila, PajouheshVaSazandegi, 13: 108-110.

Mulero, V., Esteban, M.A., Meseguer, J., (1998). In vitro levamisole fails to increase sea-bream phagocyte functions, Fish Shellfish Immunology, 8: 315-318. doi: 10.1006/fsim.1998.0141

Nayak, S.K., Swain, P., Nanda, P.K., Dash, S., Shukla, S., Meher, P.K., Maiti, N.K., (2008). Effect of endotoxin on the immunity of In-dian major carp, Labeorohita, Fish and Shellfish Immunology, 24: 394-399. doi: 10.1016/j.fsi.2007.09.005

Niromaya, M., Hata, H., Fujiki, M., Kim, M., Yamamoto, T. E., (1995). Enhancement of chemotactic activity of yellow tail leuco-cytes by oral administration of Quillajasap-onin, Fish and Shellfish Immunology, 5: 325-327. doi: 10.1006/fsim.1995.0031

Ortuno, J., Cuesta, A., Rodriguez, A., Esteban, M.A., Meseguer, J., (2002). Oral admin-istration of yeast, Saccharomyces cerevisiae, enhances the cellular innate immune re-sponse of gilthead seabream (Sparus au-rata), Veterinary Immunology and Immuno-pathology, 85: 41-50. doi: 10.1016/S0165-2427(01)00406-8

Ortuno, J., Esteban, M. A., Meseguer, J., (2003). The effect of dietary intake of vitamins C and E on the stress response of gilthead sea-bream (SparusaurataL., 1758), Fish and Shellfish Immunology, 14: 145-156. doi: 10.1006/fsim.2002.0428

Paul, B.N., Sarkar, S., Mohanty, S.N., (2004). Dietary Vitamin E requirement of mrigal, Cirrhinusmrigalafry, Aquaculture, 242: 529-536. doi: 10.1016/j.aquaculture.2004.08.037

Peddie, S., Secombes, C.J., (2003). The im-munostimulatory effects of Chevimmun in the rainbow trout (Oncorhynchusmykiss), Bulletin of the European Association of Fish Pathologists, 23: 48-51.

Peddie, S., Secombes, C.J., (2005). An overview of fish immunostimulant research, Fish Vet-erinary Journal, 8: 1-31.

Perera, H.A.C.C., Pathiratne, A., (2008). En-hancement of immune responses in Indian carp following administration of levamisole by immersion. Diseases in Asian Aquacul-ture VI. Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila, Philippines. 505p.

Ponpornpisit, A., Endo, M., Murata, H., (2001). Prophylactic effects of chemicals and im-munostimulants in experimental Tetrahy-menainfections of guppy, Fish Pathology, 36: 1-6. doi: 10.3147/jsfp.36.1

Puangkaew, J., Kiron, V., Somamoto, T., Oka-moto, N., Satoh, S., Takeuchi, T., Watanabe, T., (2004). Nonspecific immune response of rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) in re-lation to different status of vitamin E and highly unsaturated fatty acids, Fish and Shellfish Immunology, 16: 25-39. doi: 10.1016/S1050-4648(03)00028-7

Raa, J., (1996). The use of immunostimulatory substances in fish and shellfish farming, Re-views in Fisheries Science, 4: 229-288. doi: 10.1080/10641269609388587

Reid, S.G., Bernier, N.J., Perry, S.F., (1998). The adrenergic stress response in fish: control of catecholamine storage and release, Compar-ative Biochemistry and Physiology, 120: 1-27. doi: 10.1016/S0742-8413(98)00037-1

Robertsen, B., Engstad, R.E., Jorgensen, J.B., (1994). Beta-glucan as immunostimulants in fish. In: Stolen, J.S., Fletcher, T.C. (Eds.), Modulators of Fish Immune Re-sponses -Vol. 1. SOS Publications, Fair Haven, NJ, pp. 83-99.

Rottmann, R.W., Francis-Floyd, R., Durborow, R., (1992). The role of stress in fish disease. Southern Regional Aquaculture Center Pub-lication No: 474.

Rymuszka, A., Studnicka, M., Siwicki, A.K., Sieroslawska, A., Bownik, A., (2005). The immunomodulatory effects of the dimer of lysozyme (KLP-602) in carp (Cyprinus car-pioL)-in vivo study, Ecotoxicology and En-vironmental Safety, 61: 121-127. doi: 10.1016/j.ecoenv.2004.07.005

Sakai, M., (1999). Current research status of fish immunostimulants, Aquaculture, 172: 63-92. doi: 10.1016/S0044-8486(98)00436-0

Sakai, M., Otubo, T., Atsuta, S., Kobayashi, M., (1993). Enhancement of resistance to bacte-rial infection in rainbow trout, Oncorhyn-chusmykiss(Walbaum), by oral administra-tion of bovine lactoferrin, Journal of Fish Diseases, 16: 239-247. doi: 10.1111/j.1365-2761.1993.tb01253.x

Scholz, T., (1999). Parasites in cultured and feral fish, Veterinary Parasitology, 84: 317-335. doi: 10.1016/S0304-4017(99)00039-4

Secombes, C.J., 1994. Enhancement of fish phagocyte activity, Fish and Shellfish Im-munology, 4: 421-436. doi: 10.1006/fsim.1994.1038

Selvaraj, A., Samapath, K., Sekar, V., (2006). Adjuvant and immunostimulatory effect of beta glucan administration in combination with LPS enhances survival and some im-mune parameters in carp challenged with Aeromonashydrophila, Veterinary Immu-nology and Immunopathology, 114: 15-24. doi: 10.1016/j.vetimm.2006.06.011

Sharp, G.J.E., Pettitt, T.R., Rowley, A.F., Secombes, C.J., (1992). Lipoxininduced mi-gration of fish leukocytes, Journal of Leuko-cyte Biology, 51: 140-145.

Siwicki, A.K., Klein, P., Morand, M., Kicza, W., Studnicka, M., (1998). Immunostimulatory effects of dimerized lysozyme (KLP-602) on the nonspecific defense mechanisms and protection against furunculosisin salmonids, Veterinary Immunology and Immunopathol-ogy, 61: 369-378. doi: 10.1016/S0165-2427(97)00140-2

Smith, V.J., Brown, J.H., Hauton, C., (2003). Immunostimulation in crustaceans: does it really protect against infection?,Fish and Shellfish Immunology, 15: 71-90. doi: 10.1016/S1050-4648(02)00140-7

Sobhana, K. S., Mohan, C. V., Shankar, K. M., (2002). Effect of dietary Vitamin C on the disease susceptibility and inflammatory re-sponse of mrigal, Cirrhinusmrigala(Ham-ilton) to experimental infection of Aer-omonashydrophila, Aquaculture, 207: 225-238. doi: 10.1016/S0044-8486(01)00793-1

Sommerset, I., Krossoy, B., Biering, E., Frost, P., (2005). Vaccines for fish in aquaculture, Ex-pert Review of Vaccines, 4: 89-101. doi: 10.1586/14760584.4.1.89

Streitenberger, S.A., Mellado, M.P., Mas, J.A.L., Lopez, Y.P., Villegas, J.G., (2011). An orally administrable immunostimulant prod-uct for aquaculture. US Patent 2011/0225660 A1. ProbeltePharma, S:A.

Swain, P., Nayak, S.K., Nanda, P.K., Dash, S., (2008). Biological effects of bacterial lipo-polysaccharide (endotoxin) in fish: a review, Fish and Shellfish Immunology, 25: 191-201. doi: 10.1016/j.fsi.2008.04.009

Seker, E., Ispir, Ü.,Dörücü, M., (2011). Im-munostimulating effect of levamisole on spleen and head-kidney leucocytes of rain-bow trout, KafkasÜniversitesiVeterinerFakültesiDergisi, 17: 239-242

Takemura, A., Takano, T., (1997). Transfer of maternally-derived Ig M to larvae in tilapia, Orechromismossambicus, Fish and Shell-fish Immunology, 7: 355-363. doi: 10.1006/fsim.1997.0090

Wang, W.S., Wang, D.H., (1997). Enhancement of the resistance of tilapia and grass carp to experimental Aeromonashydrophilaand Edwardsiellatardainfections by several polysaccharides, Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, 20: 261-270. doi: 10.1016/S0147-9571(96)00035-5

Watanuki, H., Gushiken, Y., Takahashi, A., Ya-suda, A., Sakai, M., (2000). In vitro modu-lation of fish phagocytic cells by beta-en-dorphin, Fish and Shellfish Immunology, 10: 203-212. doi: 10.1006/fsim.1999.0237

Watanuki, H., Ota, K., Tassakka, A.C., Kato, T., Sakai, M., (2008). Immunostimulant effects of dietary Spirulinaplatensison carp, Aqua-culture, 258: 157-163. doi: 10.1016/j.aquaculture.2006.05.003

Watts, M., Munday, B.L., Burke, C.M., (2001). Immune responses of teleost fish, Australian Veterinary Journal, 79: 570-574. doi: 10.1111/j.1751-0813.2001.tb10753.x

Wedemeyer, G.A., (1996). Physiology of Fish in Intensive Culture Systems. Chapman and Hall, London.

Wendelaar-Bonga, S.E., (1997). The stres re-sponse in fish, Physiological Reviews, 77: 591-625.

Yano, T., Matsuyama, H., Mangindaan, R.E.P., (1991). Polysaccharide induced protection of carp, CyprinuscarpioL., against bacterial infection, Journal of Fish Diseases, 14: 577-582. doi: 10.1111/j.1365-2761.1991.tb00613.x

YavuzcanYildiz, H., Köksal, G., Borazan, G., KarasuBenli, A.Ç., (2006). Nitrite-induced methemoglobinemia in Nile tilapia, Oreo-chromisniloticus, Journal of Applied Ich-thyology, 22: 427-429. doi: 10.1111/j.1439-0426.2006.00761.x

Yavuzcan, H., Ergönül, M.B., (2010). Is prophy-lactic formalin exposure a stress source for gilthead sea bream (Sparusaurata) and sea bass (Dicentrarchuslabrax)?,Ankara Ün-iversitesiVeterinerFakültesiDergisi, 57: 113-118. doi: 10.1501/vetfak_0000002320

Yavuzcan, H., Meriç, I., Ergönül, M.B., (2009). Changes of non-specific immune parameters in rainbow trout Oncorhynchusmykissafter exposure to antimicrobial agents used in aq-uaculture, Journal of Applied Aquaculture, 21: 139-150. doi: 10.1080/10454430903113529

Yildiz-Yavuzcan, H., (2004). An Overwiev of Vaccine and Immunostimulant Use In Turkish Aquaculture Sector. 6th Interna-tional Symposium on Fish Immunology, 24-29, May, Turku, Finland.

Yuan, C., Li, D., Chen, W., Sun, F., Wu, G., Gong, Y., Tang, J., Shen, M., Han, X., (2007). Administration of a herbal immuno-regulation mixture enhances some immune parameters in carp (Cyprinuscarpio), Fish Physiology and Biochemistry, 33: 93-101.doi: 10.1007/s10695-006-9120-7