- (2010) Volume 4, Issue 3
Türkay Öztürk*, Ahmet Özer, Gökçe Ünsal
Sinop Üniversitesi, Su Ürünleri Fakültesi, Sinop
White spot is an important parasitic disease causing serious economical loses in cultured freshwater fish and the causative agent, Ichthyophthirius multifiliis is an ectoparasitic ciliate.In the present study, in order to determine effective therapeutants on different stages of I. multifiliis (theront, tomont and cyst) therapeutants acriflavin neutral, metranidazole, methylene blue, potassium permanganate, sodyum klorür, chloramine-T, chloramphenicol, oxytetracycline, tribressen, furazolidone were investigated in vitro. The effects of therapeutants on survival rates of the parasite individuals in different stages were evaluated with the aid of a scala of 0 (100% effective); + (75% effective); ++ (30-40% effective); +++ (non-effective). While Sodium chloride (3%, 2%, 1%), metranidazole (1‰), methylene blue (1‰) and potassium permanganate (1‰) were effective on all stages of the parasite but oxytetracycline (1‰), furazolidone (1‰) and tribrissen (1‰) had no effect on all stages of the parasite. On the other hand, it was determined that acriflavine neutral, chloramin-T and chloramphenical were effective against theront and tomont stages of the parasite but these therapeutants were ineffective against cysts.
Ichthyophthirius multifiliis, white spot disease, chemotherapeutants, in vitro
Ichthyophthiriosis ya da Ich olarak bilinen beyaz benek hastalığı tatlısu balıklarının en etkili hastalıklarından birisidir. Balıkların derisine, yüzgeçlerine ve solungaçlarına yerleşen Ichthyo-phthirius multifiliis adında silli bir protozoan pa-razitin neden olduğu bu hastalığın, en önemli be-lirtisi; 0.5- 1 mm çapında pek çok sayıda beyaz ya da grimsi renkte beneklerin balık üzerinde oluşmasıdır (Van Duijn, 1967).
Ichthyophthirius multifiliis, konakta beslendiği evresi trophont; beslenmeksizin su kütlesinde geçirdiği serbestçe yüzebilen tomont, tomite, theront evreleri ve kistik evrelerinden iba-ret özel konağı olmayan direkt yaşam döngüsüne sahip bir parazittir (Wahli ve ark., 1986). Ko-nakta bulunan ve konaktan beslenen trophont evresindeki bireyler (olgunlaşmamış trophont) olgunlaşınca konaktan ayrılıp suya geçer (to-mont) (Şekil 1) ve suyun dibine çöker. Burada yumuşak jelatin benzeri bir madde salgılayarak etrafını kaplar ve kist oluşturur. Kist evresinde çok hızlı bölünmeler geçirerek genç bireylere (tomite) (Şekil 1) dönüşür. Kistten ayrılan tomite evresindeki bireyler theront (Şekil 1) olarak ad-landırılır, su içerisinde serbestçe yüzebilir ve bir konağı enfekte edebilirler. Konağın solungaç, deri veya yüzgeçlerine yerleşen theront evresindeki bireyler (olgunlaşmamış trophont) beslenmeye başlarlar; olgunlaşan trophont birey-leri tekrar üremek için konağı terk eder (tomont) ve yaşam döngüsü bu şekilde tamamlanmış olur. Yaşam döngüsü tamamlandığında enfekte balık-larda ölüm oranının arttığı görülür (Van Duijn, 1967; Wahli ve Meier, 1985; Cross, 1994; Tojo ve ark., 1994; Dickerson ve Dawe, 1995; Dickerson ve Clark, 1998).
Şekil 1. Ichthyophthirius multifiliis’in farklı gelişim evreleri (orijinal). a-b: Tomont evresindeki bi-reyler, c: kist içindeki tomite evresindeki bireyler, d: Theront evresindeki birey.
Figure 1. Different developmental stages of Ichthyophthirius multifiliis (original). a-b: specimens of tomont stages, c: specimens of tomite stages in cyst, d: specimen of theront stage.
Günümüze kadar beyaz benek hastalığının te-davisinde pek çok kimyasal madde; çeşitli araştı-rıcılar tarafından gerek banyo tarzında (Farley ve Heckmann, 1980; Wahli ve ark., 1993; Tojo ve ark., 1994; Shinn ve ark., 2003; Jorgensen ve Buchmann, 2007) gerekse oral olarak (Wahli ve ark., 1985; Tojo ve Santamarina, 2001; Luzardo ve ark., 2003) denenmiştir. Parazitin theront ev-resindeki bireyleri inaktive etmede etkili olduğu bildirilen pek çok terapötik madde olmasına rağ-men, tüm evrelerine karşı etkili olan terapötik madde sayısı sınırlıdır. Parazitin tüm evreleri üzerine malaşit yeşili okzalat, formalin ve dimetridazol’un etkili kimyasallar olduğu bilin-mektedir (Shinn ve ark., 2003; Jorgensen ve Buchmann, 2007). Ancak malaşit yeşili ve dimetridazol etkili kimyasallar olmalarına rağ-men, karsinojen, mutajen ve teratojen etkilerin-den dolayı pek çok ülkede kullanımı sınırlandı-rılmış ya da yasaklanmıştır (Sudova ve ark., 2007). Benzer şekilde ülkemizde de bu terapötiklerin yanı sıra kloramfenikol ve furazolidon’nun da su ürünleri yetiştiriciliğinde kullanımı Tarım ve Köyişleri Bakanlığı tarafın-dan yasaklanmıştır (Anonim, 2008). Formalin uygulamalarının ise balıklarda akut fizyolojik de-ğişimlerin yanı sıra epitelyal hasarlara ve mukoz hücre yoğunluğu değişimlerine neden olduğu bil-dirilmektedir (Buchmann ve ark., 2004; Jorgensen ve Buchmann, 2007) ve kullanımı sı-nırlandırılmış.
Bu araştırmada beyaz benek hastalığının et-keni I. multifiliis parazitine karşı etkili olabilecek bazı terapötik maddelerin etkisinin incelenmesi amaçlanmıştır. Böylece akvaryum balıklarında ve alabalık gibi yoğun yetiştiriciliği yapılan tatlısu balıklarında ciddi kayıplara neden olabilen bu pa-razite karşı etkili terapötiklerin bulunmasının üre-ticilere yol göstereceği düşünülmektedir. Ayrıca tedavi amaçlı kullanılacak kemoterapötiklerin et-kili konsantrasyonlarının belirlenmesinde uygu-lamaların olası toksikasyonları veya kalıntı mad-de birikimi gibi sağlığı tehdit edici etkileri orta-dan kaldırması bakımından bu çalışmanın in vitro olarak yapılması önem taşımaktadır.
Parazit, Ichthyophthirius multifiliis bireyleri-nin elde edilmesi
Parazitler, özel bir alabalık işletmesinden te-min edilen doğal olarak infekte 6-8 g ağırlığa sa-hip yavru gökkuşağı alabalıklarından (Oncorhyn-chus mykiss) elde edilmiştir. Havalandırması bu-lunan, 16 oC sıcaklığa sahip, 15 lt kapasiteli iki cam akvaryuma 20'er adet infekte gökkuşağı ala-balığı yerleştirilmiş ve parazit bireylerinin kolay elde edilmesi için bir stok oluşturulmuştur. Para-zitin kist evresindeki bireyleri infekte balığın bu-lunduğu akvaryum suyu ve zemininden, tomont evresindeki bireyleri infekte balığın vücut yüze-yinden, theront evresindeki bireyler ise; ak-varyum zemininden alınan kistlerden elde edil-miştir. Theront evresindeki bireyleri elde etmek için akvaryum zemininden alınan kistler mikros-kop altında incelenmiş ve özellikle açılmaya ya-kın (içinde tomite görünen) kistler seçilmiştir. Akvaryum suyu ve zemininden plastik pipet ile toplanan parazitin kist bireyleri çukur lama akta-rılmış, ışık mikroskobu altında sayılmıştır. Çukur lamdaki parazit bireyleri plastik pipet yardımı ile uygulanacak kimyasalın bulunduğu petri kutula-rına aktarılmıştır. İnfekte balığın vücut yüzeyin-den elde edilen tomont bireyler bir lam üzerine alınmış, mikroskop altında sayım işlemi tamam-lanmış ve yumuşak uçlu bir fırça yardımı ile uy-gulanacak kimyasalın bulunduğu petri kutusuna aktarılmıştır. Yeni açılmış kistlerden elde edilen theront evresindeki bireyler ise dereceli plastik pipet yardımıyla alınmış, 1 ml’deki birey yoğun-luğu mikroskop altında sayılmış ve uygulanacak kimyasalın bulunduğu petri kutularına 1 ml (kon-santrasyonu değiştirmeyecek şekilde) ilave edil-miştir.
Tedavi amaçlı kullanılan terapötikler
Araştırmada balık hastalıklarının tedavisinde yaygın kullanılan terapötiklerden akriflavin nötral, metranidazol, metilen mavisi, potasyum permanganat, sodyum klorür, kloramin-T, klo-ramfenikol, oksitetrasiklin, tribrissen ve furazoli-don kullanıldı. Kullanılan terapötikler ve oranları Tablo 1’de verilmiştir.
Tablo 1. Araştırmada kullanılan terapötik mad-deler ve in vitro uygulanma oranları
Table 1. The therapeutant substanses and in vi-tro doses used in the present study
Terapötiklerin Uygulanması ve Değerlendirme
Tablo 1’de belirtilen terapötikler parazitlere in vitro olarak uygulanmıştır. Uygulamalar 5.5 cm çaplı cam petri kutularında gerçekleştirilmiş olup her kimyasaldan ve oranlarından eşit miktarda (10 ml) kullanılmıştır. Uygulamalar oda sıcaklığında gerçekleştirilmiştir. Terapötik maddelerin her bir oranı, 75-100 theront/ml, 5-8 tomont/ml ve 5-8 kist/ml bulunan petri kutu-larında ayrı ayrı uygulanmıştır. Her bir ke-moterapötik uygulandıktan 5, 30, 60, 120, 180 dk sonra parazitin theront, tomont ve kist evresindeki bireylerinin mikroskop altında (10x) canlılıkları tespit edilmiştir. Theront ve tomont evresindeki bireylerin hücre içi ve sil hareketleri durduğunda, kistlerin ise kist içindeki tomite evresindeki bireylerin hareketleri durduğunda öldükleri kabul edilmiştir. Parazitlere karşı etkili olan terapötik maddeler bir skala yardımıyla de-ğerlendirilmiştir. Skala,
0: canlı parazit yok (kimyasal madde %100 etkili; 0/20 theront, 0/10 tomont, 0/10 kist),
+: yaşama oranı düşük (kimyasal madde %75 etkili; ≤5/20 theront, ≤3/10 tomont, ≤3/10 kist),
++: yaşama oranı orta (kimyasal madde % 30-40 etkili; 6-16/20 theront, 4-8/10 tomont, 4-8/10 kist),
+++: yaşama oranı yüksek (kimyasal madde et-kisiz; 17-20/20 theront, 9-10/10 tomont, 9-10/10 kist)
olarak belirlenmiştir.
Araştırma süresince theront, tomont ve kist evresindeki bireylerin yaşama oranlarının belir-lendiği denemelerle eş zamanlı ve eşit sayıda theront, tomont ve kist içeren petri kutuları kont-rol grubu olarak kullanılmıştır. Kontrol grubu olarak ayrılan petri kutularına herhangi bir terapötik madde uygulanmamıştır.
Ichthyophthirius multifiliis parazitinin theront, tomont ve kist evreleri üzerine uygulanan terapötik maddelerin oranları ve etki süreleri ile ilgili elde edilen sonuçlar Tablo 2’de verilmiştir.
Kullanılan terapötik maddelerden akriflavin nötral (%1), kloramin-T (%1), potasyum per-manganat (‰1), metranidazol (‰1) ve sodyum klorür (%3, %2, %1) parazitin theront evresinde-ki bireylerin tamamını 5 dk, tomont evresindeki bireylerin tamamını ise 30 dk içinde; aynı terapötik maddelerin daha düşük konsan-trasyonları therontları 30 dk, tomontları ise 60 ile 180 dk arasında değişen sürelerde etkisiz hale ge-tirmiştir. Araştırmada iki farklı oranda uygulanan kloramfenikol’ün sadece ‰1’lik kon-santrasyonun parazitin theront (120 dk) ve to-mont (180 dk) evreleri üzerine etkili olduğu, uy-gulanan 100 ppm’lik konsantrasyonun ise pa-razitin üç evresi üzerine de etkili olmadığı belir-lenmiştir (Tablo 2).Araştırmada kist evresi üzerine en kısa sürede (30-60 dk) etki eden terapötik maddenin sodyum klorür (%3, %2) olduğu tespit edilmiştir. Etkili olan diğer terapötiklerden potasyum permanganat (‰1), metranidazol (‰1), sodyum klorür (%1) ve metilen mavisi (‰1) ise kist evresindeki bi-reyleri 180 dk içerinde etkisiz hale getirmiştir. Benzer terapötiklerin daha düşük konsan-trasyonları (10 ppm’lik potasyum permanganat ve 50 ppm’lik metranidazol) kistlerin üzerinde kısmen etkili olduğu (180 dk da ancak %30-40 etkili) belirlenmiştir. Ayrıca, akriflavin nötral, kloramin-T, kloramfenikol, oksitetrasiklin, fura-zolidon ve tribrissen’in uygulanan bütün konsan-trasyonlarının kist üzerinde etkili olmadığı sap-tanmıştır (Tablo 2).
Tablo 2. Ichthyophthirius multifiliis ‘in farklı gelişim evreleri üzerine uygulanan terapötik maddelerin in vitro etkisi ile ilgili sonuçlar
Tablo 2. Results about in vitro efficacy of therapeutant substances used on different development stages of Ichthyophthirius multifiliis
Araştırmada oksitetrasiklin, furazolidon ve tribrissen’in uygulanan bütün konsantrasyonları-nın I. multifiliis parazitinin üç evresi üzerine de öldürücü bir etkisi olmadığı belirlenmiştir (Tablo 2).
Tedavi uygulanmayan kontrol grubundaki theront, tomont ve kistlerin gözlem periyodu bo-yunca canlılıklarını kaybetmediği gözlenmiştir.
Beyaz benek hastalığına karşı etkili bir te-daviden bahsedebilmek ya da bir başka ifade ile hastalığı kontrol altına alabilmek için paraziti öl-dürmek ya da yaşam döngüsünü kesmek gerek-mektedir. Bu durumda parazitin tüm ya da infektif evredeki bireylerini öldürebilecek etkiye sahip, uygun terapötik maddeyi bulmak önem-lidir. Bu çalışmada kullanılan ve in vitro olarak uygulanan terapötik maddeler içinde potasyum permanat (‰1), metilen mavisi (‰1), metranida-zol (‰1) ve sodyum klorür (%3, %2, %1) beyaz benek hastalığının etkeni I. multifiliis parazitinin tüm evreleri üzerine etkili olduğu bulunmuştur. Bu sonuç özellikle akvaryum balıklarındaki be-yaz benek hastalığının tedavisinde tuz, metilen mavisi, akriflavin ve kloramin-T’nin etkili oldu-ğunu ve güvenle kullanılabileceğini öneren Cross (1972)’ nin bulgularıyla kısmen uyum içerisinde-dir.
Kullanılan diğer terapötik maddelerden akri-flavin nötral, kloramin-T ve kloramfenikol pa-razitin theront ve tomont evresindeki bireyler üz-erinde etkili olmasına rağmen, kist evresindeki bireyler üzerinde etkili bulunmamıştır. Van Duijn (1967), akriflavin nötral ve antibiyotiklerin I. multifiliis üzerinde etkili olmadığını bildirmiş, fakat bu araştırmada parazitin serbest yüzen evreleri üzerine akriflavin nötral ve kloramfeni-kol’ün (‰1) etkili olduğu gözlenmiştir. kloram-fenikol’ün ‰1’lik konsanrasyonu theront ve to-montlar üzerinde öldürücü etki göstermiştir, fakat aynı antibiyotiğin daha düşük konsantrasyonu (100 ppm) ve diğer antibiyotiklerin (oksitetrasik-lin, furazolidon ve tribrisen) uygulanan konsan-trasyonları, parazitin her üç evresi üzerine de et-kisiz bulunmuştur. Parazitin çeşitli evreleri üz-erine in vitro uygulanan antibiyotiklerin bu araştırmada etkisiz kalmasına rağmen, bu hastalığın tedavisinde özellikle parazitin konakta beslendiği trophont evresindeki bireyleri etkisiz hale getirmek için bazı antibiyotiklerin oral yolla balıklara verilmesi son yıllarda sıkça başvurulan uygulamalar arasında yer almaktadır (Tojo ve Santamarina, 2001; Luzardo ve ark., 2003; Andrade ve ark., 2006). Bu nedenle bu çalışmada elde edilen özellikle antibiyotik kullanımı ile ilgili sonuçlar etkisiz tedavileri elemine etmede yardımcı olacaktır.
Bu çalışmada, parazitin infektif evresi olan therontların, tomont ve kist evrelerine göre uy-gulanan terapötiklerin çoğuna karşı daha hassas olduğu bulunmuştur. Etkili bulunan terapötik maddelerin theront bireylerini çok daha hızlı öldürdüğü, tomont ve kistleri ise daha uzun sürede öldürdüğü tespit edilmiştir. Kistlerin üz-erine daha az sayıda terapötik maddenin etki et-mesi ve terapötik maddelere karşı dayanıklı ol-masının nedeni, jelatinimsi kist duvarının terapötiklere karşı koruyucu görevinden kaynak-lanabilir (Wahli ve ark., 1993).
Parazitin her üç evresi üzerine de etkili bulu-nan sodyum klorür, metranidazol, metilen mavisi ve potasyum permanganatın beyaz benek hastalığının tedavisi için banyo tarzında uygu-lanabileceği önerilebilir. Fakat parazitin her üç evresi üzerinde de etkili olan bu terapötiklerin hazırlanan konsantrasyonları, infekte balıklara uygulanmadan önce balıklar üzerine olumsuz et-kileri bakımından kontrolünün yapılması gerek-mektedir. Özellikle parazitin kist evresindeki bi-reyleri terapötik maddelere karşı diğer iki evreye göre daha dayanıklı olduğundan terapötik mad-denin uygulama süresi uzayabilmektedir.
Tedavi için seçilen kimyasal maddelerin ba-lıklar üzerinde olumsuz etkilerinin araştırılması-nın yanı sıra, tedavi amacıyla tercih edilen meto-dun kolay uygulanır olması, kimyasalların ucuz ve kolay temin edilebilir olması da göz önünde bulundurulmalıdır. Bütün bu özellikler göz önün-de bulundurulduğunda parazitin her üç evresi üzerine etkili bulunan kimyasalların kullanımı tedavi için sakıncalı bir durum oluşturuyorsa kist evresine nazaran kimyasallara daha hassas olan theront veya tomont evreleri üzerine etkili terapötik maddelerden uygun olanı seçilebilir.
Bu anlamda araştırmada kullanılan ve in vitro olarak uygulanan terapötik maddelerden elde edi-len deneme sonuçlarına göre potasyum permanat (‰1), metilen mavisi (‰1), metranidazol (‰1) ve sodyum klorür (%3, %2, %1) beyaz benek hastalığının etkeni I. multifiliis parazitinin theront, tomont ve kist evreleri üzerine etkili olup, kullanımları önerilebilir.
