- (2008) Volume 2, Issue 1
Bahar Tokur*, Seval Kandemir
Çukurova Üniversitesi, Su Ürünleri Fakültesi, BalcalÃÆÃââââ¬à ¾ÃÆââ¬Å¡Ãâñ-Adana
In this study, the effects of thawing in running water, microwave and room temperature on protein quality of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and sardine (Sardina pilchardus) were investigated. The amounts of myofibriller protein, protein solubility and Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) were analyzed to determine the proteinquality of fish. The amount of myofibriller protein significantly decreased in each two fish species as a result of freezing-thawing process (p0.05). Thawing in microwave and room temperature caused a decrease in the amount of myofibriller proteins of rainbow tout and sardine (p0.05) In general, freezing-thawing process caused a significant decrease in protein solubility (p0.05), while the effect of different hawing process on protein solubility changed depending on fsh species. The highest protein solubility in rainbow torut and sardine obtained with thawing in running water. As a result of SDS-PAGE, it was found that the different thawing methods didn’t cause protein denaturation via disulfide covalent bonds. According to these data, it was suggested that the reason of the decrease in protein solubility could be resulted from polymerization of protein via non-disulphide covalent bonds and/or interaction of protein with other compounds such as the lipid-protein interaction.
Frozen fish quality, different thawing methods, protein solubility, SDS-PAGE
Su ürünlerinin dondurularak depolanması en önemli muhafaza yöntemlerinden birisidir. Ancak, dondurma ve çözündürme işlemleri esnasında istenmeyen bir çok kalite kayıpları meydana gelir. Dondurulmuş su ürünlerinde kalite kaybına neden olan en önemli faktörler arasında depolama sıcaklığı, dondurma-çözündürmenin sayısı, sıcaklık dalgalanmaları ve uygunsuz dondurma-çözündürme işlemleri verilebilir (Sikorski ve ark., 1976).
Dondurulmuş balığın kas proteinlerinde geri dönüşümü olmayan değişimler, balığın kas proteinlerinin fonksiyonel özelliklerinin bozulmasına, su tutma kapasitesinin azalmasına ve balıkta sulu-yumuşak ya da kuru ve sert bir kas dokusu oluşmasına neden olur. Protein denatürasyonu olarak bilinen bu değişimler, yapısal kas proteinlerinin özellikle de myofibrillar proteinlerin çökelmesi/indirgenmesi sonucu ortaya çıkar. Proteinlerin çökelmesi/ indirgenmesi, disülfit, hidrojen ve hidrofobik bağlarla proteinlerde dicerler, trimerler ve yüksek moleküler ağırlıklı polimerlerin oluşması veya kısım-kısım çökelmesi ile oluşur. Dondurulmuş balıklarda yapılan çoğu çalışma, protein-protein kros-linklerle olduğu gibi (Sikorksi, 1978; Del Mazo ve ark., 1999; Jasra ve ark., 2001), protein-lipit interaksiyonuyla da (Haard, 1992; Saeed ve ark., 1999; Saeed ve Howell, 2002) balık kas proteinlerinin polimerleştiğini veya bölündüğünü göstermiştir. Kontraktil proteinler içerisinde myosin ağır zinciri (MHC), M-protein, tropomyosin ve Troponin I, C en fazla denatürasyona uğrayan proteinler olduğu fakat bu oluşumların balık türlerine bağlı olarak değiştiği belirtilmektedir (Benjakul ve Bauer, 2000).
Genellikle, doğal kas yapısı hidrojen bağları, dipole-dipole interaksiyonu, elektrostatik interaksiyonlar ve disülfit linkleri içeren bir çok kuvvet tarafından stabildirler. Proteinler, kuvvetlerin stabilitesinin bozulması ile denatüre olabilirler ve bu durum dondurma çözündürme döngüsü gibi sıcaklığın uygunsuz bir şekilde kullanılması ile artabilir (Wagner ve Anon 1985; Benjakul ve Bauer, 2000). Çözündürme genellikle dondurmadan çok daha yavaş oluşur ve dondurulmuş ürünün tekstürel yapısına zarar verir (Nott ve ark., 1999; Zhu ve ark., 2004). Çözündürme metotlarının duyusal analiz kadar membran integresinde önemli rol oynadığı ve hızlı çözündürmenin yavaş çözündürmeye oranla daha iyi sonuç verdiği bulunmuştur (Nilsson ve Ekstrand, 1994;1995).
Mol ve ark. (2004), farklı çözündürme yöntemlerinin (su içerisinde, oda sıcaklığında ve buzdolabı sıcaklığında) dondurulmuş uskumruların (Scomber scombrus) kalitesini önemli bir şekilde değiştirmediğini bulmuşlardır. Yapılan araştırmalara göre en iyi çözündürme ile ilgili genel ve geçerli bir bilgi verebilmenin mümkün olmadığı belirtilmektedir (Baygar ve ark., 2004). García-Arias ve ark. (2003) taze ve dondurulmuş sardalyaların buzdolabında +4°C’ de veya mikrodalgada çözündürdükten sonra ızgara yapılması sonucu protein kalitesinde meydana gelen değişimi incelemişler ve bunun sonucunda buzdolabında çözündürmenin protein çözünürlüğünü azalttığını bulmuşlardır. Balıkların dondurulması, dondurma-çözündürme döngüsüne ilişkin bir çok çalışma olmasına rağmen farklı çözündürme metotlarının balığın protein kalitesine olan etkisi ile ilgili çok az çalışma bulunabilmiştir. Bu çalışma ile, dondurarak depolanmış alabalık ve sardalyada farklı çözündürme şekilleri sonucu protein kalitesinde meydana gelen değişimler incelenerek konuya ışık tutulmaya çalışılmıştır..
Araştırmada, alabalık (Oncorhynchus mykiss) ve sardalya (Sardina pilchardus) kullanılmıştır. Lokal balıkçılardan satın alınan balıklar buz içinde laboratuvara getirilerek 2 lota ayrılmıştır. Balıkların bir kısmı taze balıktaki kimyasal parametrelerin belirlenmesi için ayrılmış diğerleri ise hemen buzdolabı poşetleri içinde -18°C’ de dondurularak 3 ay boyunca depolanmıştır. Dondurulmuş balıkların çözündürülmesinde en fazla uygulanan çözündürme metotlarından mikrodalgada çözündürme (180 W), akan su altında çözündürme ve oda sıcaklığında (24°C) çözündürme olmak üzere 3 farklı yöntem kullanılmıştır. Çalışmada kimyasal analizler her bir lota 3 paralel olarak yapılmıştır.
Balığın başlangıç ve dondurmadan öncekisonraki tazeliğini belirlemek için toplam uçucu bazik azot (TVB-N, mg N /100 gr örnek) tayini Antonocopoulus (1973)’ a göre ve pH ölçümleri Santos (1981)’ a göre yapılmıştır.
Myofibriller proteinlerin çözünürlüğü Dyer ve ark. (1950)’ nin yöntemine göre belirlenmiştir. Bunun için 0.5 gr balık örneği 10 ml 0.6 M NaCl ve 50 mM sodyum fosfat buffer solüsyonunda ultra-turax kullanılarak 1 dakika buz içinde homojenize edilmiştir. Örneklerin ekstraksiyon esnasında oksitlenmesini önlemek için %0.1 oranında butil-hidroksi-toluen (BHT) kullanılmıştır. Ekstrakte edilen örnekler daha sonra 5000 rpm de ve 4 °C’ de 20 dakika santrifüj edilmiştir. Örneklerdeki protein miktarı Lowry ve ark. (1951) metoduna göre saptanmıştır. Protein standardı olarak bovine serum albümin kullanılmıştır.
Balıkların çözündürülmesi esnasındaki proteinlerde meydana gelen denatürasyonu incelemek için, BioRad marka mini vertikal sodyum dodesil sülfat (SDS)- polyakrilamid jel elektroforezi (PAGE) kullanılmıştır. Elektroforez işlemi %10’ luk polyakrilamid jel ile Laemmli (1970) metoduna göre yapılmıştır. Jeller, % 0.025 Coomassie Blue R-250, %40 metanol ve %7 asetik asit ile boyanmıştır ve fazla boya % 5 metanol ve% 7 asetik asit ile 24 saat bekletilerek alınmıştır. Proteinlerin moleküler kütlesini belirlemek için, myosin (211,24 kDa), β-galaktosidaz (117,76 kDa), bovin serum albumin (99,81 kDa) ve ovalalbumin (49,78 kDa) içeren SDS-PAGE standardı (BioRad-161-0309) kullanılmıştır.
Farklı çözündürme metotları uygulanan alabalık ve sardalyanın pH, toplam uçucu bazik azot (TVB-N, mg/ 100 gr), myofibriller proteinler ve protein çözünürlüğündeki değişimler Tablo1 de verilmiştir.
Her iki balık türünde TVB-N düzeylerinin dondurma-çözündürme işlemleri esnasında yükseldiği görülmüştür. Oda sıcaklığında çözündürülmüş alabalık ve sardalyaların TVB-N düzeylerinin akan su ve mikrodalga ile çözündürülenlerden daha yüksek olduğu bulunmuştur (p<0.05). Benzer şekilde, Mol ve ark. (2004) oda sıcaklığında çözdürülen dondurulmuş ithal uskumru balıklarının TVB-N düzeylerinin suda çözdürülenlere göre daha yüksek olduğunu bulmuşlardır. Balıkların TVB-N düzeyleri taze balık için Avrupa Birliği Kriterlerine göre belirtilen düzeylerin (35mg/100g et) altında bulunmuştur (EC, 1995). Buna göre balıkların dondurma ve çözündürme işlemleri esnasında tüketilebilirlik sınırını aşamadığı tespit edilmiştir. Elde edilen verilere göre, TVB-N miktarının balık türlerine ve çözündürme şekline göre değiştiği bulunmuştur. Balık etinde tespit edilen TVB-N değerleri üzerine başlıca balığın cinsi, avlama mevsimi, avlama derinliği, avlanma bölgesi, balığın beslenme durumu, olgunluk derecesi, cinsiyeti ve yaşı oldukça etkilidir (Oehlenschläger, 1989). Araştırma sonucuna göre, TVB-N düzeyleri bakımından sardalya için akan su ve mikrodalga en uygun çözündürme işlemleri olarak önerilebilir (p<0.05).
Tablo 1.: Farklı çözündürme metotları uygulanan alabalık ve sardalyanın pH, TVB-N, myofibriller protein ve protein çözünürlüğündeki değişimleri1,2 (The changes of pH, TVB-N, myofibrillar protein and protein solubility of rainbow trout and sardine thawed with different methods).
Sardalya için farklı koşullarda çözündürmenin pH üzerinde önemli bir etkisinin olmadığı bulunmuştur (p>0.05). Benzer sonuçlar, dondurulmuş ithal uskumru balıklarında da bulunmuştur (Mol ve ark., 2004).
Alabalık ve sardalyada taze balığa göre dondurma ve çözündürme işlemleri myofibriller proteinlerin miktarında azalmaya neden olmuştur (p<0.05). Genel olarak dondurma ve çözündürme işlemi her iki balık türünde de protein çözünürlüğünde önemli bir azalmaya neden olurken (p<0.05), farklı çözündürme işleminin protein çözünürlüğüne olan azaltıcı etkisi alabalıkta daha az olmuştur. En yüksek protein çözünürlüğü, akan su altında çözündürülme ile sağlanmıştır. Benjakul ve Bauer (2000), dondurma ve çözündürme işlemi sırasında morinada meydana gelen protein çözünürlüğündeki azalmanın proteinlerin denatüre olmasından kaynaklandığını öne sürmektedirler. Dondurma ve çözündürme işlemi sırasında meydana gelen bu denatürasyonun balığın tekstürel yapısında önemli değişimlere neden olduğu belirtilmektedir (Ang ve Hultin,1989; Ragnarrsson ve Regenstein, 1989). García-Arias ve ark. (2003) buzdolabında çözündürülen sardalya filetolarının protein çözünürlüğünün azaldığı fakat mikrodalgada arttığını bulmuşlardır. Bu sonuca göre, genel olarak farklı çözündürme işlemlerinin balığın proteinlerinde çok önemli değişimlere neden olmadığı vurgulanmaktadır. Buna rağmen, Tejada ve ark. (1985) dondurulmuş sardalya balığında protein çözünürlüğünde önemli bir azalma meydana geldiğini ve bunun nedeninin stabil kovalent bağların oluşmasından kaynaklandığını belirtmektedirler. Srinivasan ve ark. (1997) mikrodalganın daha hızlı çözündürmeye neden olduğu fakat protein denatürasyonuna sebep olduğu ve büyük karidesler için arzu edilmeyen bir çözündürme metodu olduğunu belirtmişlerdir.
Figure 1: Distribution of electrophoretic protein profile of rainbow trout and sardine thawed with different methods based on molecular weights (MW; molecular weight, kDa; kilo Dalton, Sa; sardine, Al; trout).
Bu çalışmada, di-sulfit bağları indirgeyen β-marcaptoethanol ile reaksiyona sokulan örneklerin SDS-PAGE analizi ile özellikle proteinlerde di-sulfit ve non-disulfit kovalent bağlarla meydana gelen protein-protein interaksiyonu saptanmaya çalışılmıştır (Şekil 1). Buna göre, alabalık ve sardalyanın kas proteinlerinde farklı çözündürme metotlarının dikkate değer bir değişim meydana getirmediği tespit edilmiştir. Sadece akan su altında ve oda sıcaklığındaki bantların yoğunluğunda taze ve mikrodalgaya göre çok zayıf bir azalma görülmektedir. Taze balıkla tüm çözündürme işlemleri karşılaştırıldığında dikkate değer bir değişimin olmaması, çözündürme işleminin balık proteinleri üzerine çok büyük bir değişime neden olmadığını göstermektedir. Bantlarda görülen azalma ise balıklarda belirli molekül ağırlığına sahip proteinlerin non-disülfit kovalent bağlarla denatüre olduğunu göstermektedir. Proteinlerin sadece disülfit bağlarla değil non-disülfit kovalent bağlarla bağlanarak da yüksek moleküler ağırlıklı polymerler oluşturduklarını ve çökelerek proteinlerin denatürasyonuna yol açtıkları da söylenebilir (Ragnarsson ve Regenstein, 1989). Ayrıca, dondurarak depolama sırasında meydana gelen protein denatürasyonunun protein çözünürlüğünü azalttığı ve bunun nedeninin disülfit bağlar ve protein molekülleri arasındaki iyonik interaksiyonlar olduğu kadar intermoleküler hidrojen veya hidrofobik bağlarla da oluşabileceği belirtilmektedir (Matsumoto 1980; Akahane 1982; Badii ve Howell 2002). Jiang ve ark. (1987), dondurarak depolama esnasında protein moleküllerinin –C=O ve –N-H gruplarıyla olan hidrofilik interaksiyonlarının proteinlerin denatürasyonuna ve çökelmesine neden olabileceğini ve bununda protein çözünürlüğünü ve Ca-ATPase aktivitesini azaltabileceğini belirtmektedirler. Bunun yanında, proteinlerin fonksiyonel gruplarının çok doymamış yağ asitlerinin oksidasyon ürünleriyle olan reaksiyonlarından da çökelme ve karşı-bağlanma olabileceği belirtilmektedir (Saeed ve Howell, 2002). Bu çalışmada, SDS-PAGE analizi sonucunda protein çözünürlüğündeki azalmanın disülfit kovalent bağlar sonucu oluşmadığı, ancak diğer non-disülfit kovalent bağla ve/veya diğer bağlar ve interaksiyonlarla oluştuğu söylenebilir.
Farklı çözündürme işlemleri, protein çözünürlüğünde önemli bir azalmaya neden olmuştur. Fakat bu azalmanın balığın türüne ve çözündürme işlemine bağlı olarak değiştiği bulunmuştur. SDS-PAGE analizi, di-sulfide kovalent bağlarla herhangi bir denatürasyonun olmadığını göstermiştir. Bu çalışma sonucunda elde edilen verilere göre, protein çözünürlüğündeki azalmanın ancak non-disülfit kovalent bağlarla veya proteinlerin diğer bileşiklerle olan interaksiyonuyla oluşabileceği söylenebilir. Ancak, farklı çözündürme şekillerinin sebep oluğu denatürasyonun tam olarak tespiti için daha ayrıntılı çalışmalara gereksinim vardır.
